四種石斛的薄層鑒別及多糖含量測定

張 婷 劉安韜 劉喜華 滕建北

1.廣西衛生職業技術學院藥學系中藥教研室，廣西南寧 530023；2.廣西中醫藥大學藥學院中藥鑒定教研室，廣西南寧 530001

石斛藥材為蘭科植物金釵石斛Dendrobium nobile Lindl.、鼓槌石斛Dendrobium chrysotoxum Lindl.、流蘇石斛Dendrobium fimbriatum Hook.的栽培品及同屬植物近似種的新鮮或干燥莖[1]。最早見于《神農本草經》，具有益胃生津、滋陰清熱之功效。研究表明石斛含多糖、生物堿、酚類等多種有效成分，其中石斛多糖具有增強機體免疫力功能[2]、防止機體氧化衰老、降低血糖血脂與抗炎等藥理作用，臨床上主要用于腫瘤、糖尿病、循環系統疾病等[3-17]，具有良好的應用開發前景。但石斛藥材來源復雜，性狀與顯微特征較為相似，為保證石斛用藥安全，本文對石斛的四種常用種類美花石斛、金釵石斛、鼓槌石斛和流蘇石斛進行了薄層色譜鑒別研究，并建立了這四種石斛多糖含量測定方法，對比了四種石斛的多糖含量差異，為這四種石斛的質量研究和產品開發提供科學依據。

1 材料

1.1 儀器

UV-2600 紫外可見分光光度計[島津儀器（蘇州）有限公司]；SQP 型分析天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]；KQ-500DA 數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SIM-F140AY65-PC 制冰機（日本，松下電器產業株式會社）；Direct-Q5UV純水儀（默克密理博）；BSA224S 分析天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]；Medifuge 離心機（賽默飛世爾科技中國有限公司）；電熱鼓風干燥箱（上海一恒科技儀器有限公司）；HH-6 數顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）；H22-X3 紅外爐（杭州九陽生活儀器有限公司）；DFY-500 打粉機（溫嶺市林大機械有限公司）。

1.2 試藥

50 mm×100 mm 硅膠G（青島海洋化工有限公司）；0.3 mm×100 mm 毛細管（上海長城科學儀器商店經銷）；GUZ3-J387 毛蘭素（中國食品藥品檢定研究 院，111874-201603）；LM76-PSS7 石 斛酚（中國食品藥品檢定研究院，111875-201202）；LDOU-02FZ 石斛堿（中國食品藥品檢定研究院，111876-201503）；碘（天津市大茂化學試劑廠，CAS NO：7553-56-2）；其他試劑均為國產分析純。

1.3 實驗材料

美花石斛、金釵石斛、鼓槌石斛、流蘇石斛原生藥材（采自廣西河池市宜州區），經廣西中醫藥大學中藥鑒定教研室滕建北教授鑒定為蘭科石斛屬植物美花石斛、金釵石斛、鼓槌石斛、流蘇石斛的莖。

1.4 統計學處理

通過SPSS 19.0 統計學軟件對四種石斛的多糖含量進行均值、方差統計處理。顯著性檢驗為F檢驗，置信水平為95%。

2 薄層色譜鑒別

2.1 供試品溶液的制備

精密稱取美花、金釵、鼓槌石斛三種藥材粉末（過三號篩）各1 g 和流蘇石斛粉末（過三號篩） 0.5 g，參照《中華人民共和國藥典》2015年版一部[1]薄層色譜法（通則0502）試驗。

2.2 對照品溶液的制備

精密量取2 ml 甲醇溶液加入2 mg 石斛堿瓶中，配制成每1 ml 溶液里含1 mg 石斛堿作為對照品；精密量取2 ml 甲醇溶液加入0.4 mg 毛蘭素瓶中，配制成每1 ml 溶液里含0.2 mg 毛蘭素作為對照品；精密量取2 ml 甲醇溶液加入0.4 mg 石斛酚瓶中，配制成每1 ml 溶液里含0.2 mg 石斛酚作為對照品。

2.3 薄層色譜條件及薄層鑒別

將供試品及對照品溶液各10 μl 點于同一硅膠G 板，（60～90℃）石油醚-丙酮（7 ∶3）溫度28.6℃濕度50%～60%。展開（展距約為8 cm），碘熏顯色。薄層色譜圖見圖1。

由圖1 可知，四種石斛的斑點與石斛堿對照品斑點均相對應，說明石斛堿在四種石斛中均存在；其中鼓槌石斛和流蘇石斛斑點顏色相對較淺，說明其含的石斛堿含量較低；在毛蘭素斑點相應位置中，其他三種石斛均沒有顯出斑點，僅鼓槌石斛在相應位置有斑點，說明毛蘭素成分在四種石斛中僅鼓槌石斛含有；與石斛酚斑點可對應的有美花石斛、金釵石斛和鼓槌石斛，說明石斛酚成分在此三種石斛中均含有。

3 四種石斛多糖含量測定

3.1 標準品溶液的制備

用分析天平精密稱定0.009 g D-無水葡萄糖標準品置100 ml 容量瓶中，加蒸餾水溶解至刻度線，配制成每1 ml 含90 μg（即0.09 mg/ml） 的對照品溶液，即得。

3.2 供試品溶液的制備

精確稱取金釵石斛、鼓槌石斛、流蘇石斛粉末、美花石斛粉末（過三號篩）各0.3 g 各平分六份，置250 ml 錐形瓶中，加蒸餾水250 ml，加熱回流2 h 后，待冷卻后加純水補重。過濾，精密吸取2 ml 續濾液，置于刻度為15 ml 的離心管中，加入無水乙醇10 ml，搖勻后、冷藏1 h 后，離心（轉速為4000 r/min）20 min，沉淀再加8 ml 的80%乙醇洗滌2 次，離心10min，沉淀加熱水溶解，轉移至5 ml 量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻，即得。

3.3 顯色測定方法

精密量取1 ml 的供試品溶液，依次放置于25 ml具塞試管中。精密加入5%苯酚溶液1 ml，充分搖勻。精密加入濃硫酸5 ml，置沸水中加熱20 min 后，立即放入冰浴中冷卻5 min。

另精密量取2 ml 蒸餾水，以相同方法，作為空白對照，照紫外-可見分光光度法，在485 nm 波長處測定吸光度。

3.4 波長檢測

精密量取供試品溶液1 ml，以D-無水葡萄糖溶液作對照，在紫外-可見分光光度儀器全波長進行掃描，蒸餾水作為空白。結果供試品與對照品最佳吸收波長為485 nm，因此確定485 nm 為檢測波長。

3.5 線性關系考察

分別精密吸取D-無水葡萄糖對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml 加入20 ml 具塞試管中，按照“3.3 項下”顯色。照紫外-可見分光光度法，在485 nm 波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標（y），葡萄糖濃度為橫坐標（x），繪制標準曲線。得到線性回歸方程y=10.044x+0.0063，R=0.9994，實驗結果表明，葡萄糖的濃度在0.009～0.090 mg/ml 范圍內線性關系良好。

3.6 精密度實驗

精密吸取1 ml 供試品溶液，照紫外-可見分光光度法，檢測方法同“3.5”項下，連續測定6 次，精密度試驗的RSD 結果為0.52%，精密度良好。

3.7 穩定性試驗

精密吸取1 ml 供試品溶液，檢測方法同“3.5”項下，分別在0、10、20、30、40、50、60、90、120 min 時測定其吸光度，連續測定2 h。鼓槌石斛多糖RSD值為0.78%。

3.8 重復性試驗

稱取鼓槌石斛粉末，過3 號篩，精密稱定0.3 g，按“3.2”項下制備供試品溶液，精密量取1 ml，放入具塞試管中，按照“3.5”項下方法測定，結果顯色RSD 值為2.07%。

3.9 加樣回收率試驗

精密稱定D-無水葡萄糖0.83 mg，加入蒸餾水溶解，定容至25 ml 容量瓶。取6 支20 ml 具塞試管，精密量取葡萄糖對照品0.5 ml，再量取“3.2”項下的鼓槌石斛的供試品溶液0.5 ml，照“3.3”項顯色測定吸光度計算回收率，平均加樣回收率為100.40%，RSD 值為3.10%。

3.10 樣品的測定

分別精密稱取四種石斛供試品溶液（每個樣品平行6 次），按“3.5”項下進行吸光度測定，計算多糖含量（表1）。

由表1 可知，美花石斛多糖含量高于其他三種石斛，鼓槌石斛多糖含量低于其余三種；四種石斛的多糖含量由大到小依次為美花石斛＞金釵石斛＞流蘇石斛＞鼓槌石斛（24.02%＞13.48%＞8.55%＞6.55%）。

表1 四種石斛的多糖含量測定結果（n=6）

四種石斛多糖差異有統計學意義（P＜0.05），說明四種石斛的多糖含量差異都極顯著。

4 討論

薄層色譜（TLC）也叫薄層層析，因分離是在一平面薄層上進行而得名。因其快速、簡便和微量的特點而得到廣泛應用，薄層色譜的基本原理是利用各成分對同一吸附劑吸附能力不同，使在流動相（溶劑）流過固定相（吸附劑）的過程中，連續的產生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，從而達到各成分的互相分離的目的。薄層色譜法是目前中藥材鑒別常用的鑒別方法，具有操作簡便、直觀、分辨力高、適用性強等優點，在《中華人民共和國藥典》（2015年版）[1]中被廣泛采用[10-11]。

鑒于石斛種類較多[9]，性狀與顯微特征較為相似，難以正確鑒別石斛藥材，因而本研究采用薄層鑒別法對四種石斛進行鑒別研究，實驗結果表明毛蘭素可作為鼓槌石斛的鑒別成分，填補了目前石斛的薄層鑒別研究[18-19]的空白，且專屬性良好。

中藥中的多糖類成分具有豐富的藥理活性，如豬苓多糖、香菇多糖等有抗腫瘤的作用，人參多糖有增強免疫的作用[20]，石斛多糖具有抗衰老、增強免疫力[20-21]、抗腫瘤[22]等作用，多糖一般由D-葡萄糖，D-阿拉伯糖和D-半乳糖等聚合而成，因其在強酸中反應成醛，進一步與酚類縮合產生特有的有色物質，因此硫酸蒽酮法和鹽酸苯酚法可以用來測定多糖的含量，研究表明硫酸苯酚法較為穩定，作為多糖含量測定的方法更為理想[20]。本實驗選取石斛鮮莖，采用鹽酸苯酚法進行多糖含量的測定，采用合理的定容方式，準確測定了金釵石斛、鼓槌石斛、流蘇石斛的多糖濃度，為石斛質量評價提供依據。