HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地醋莪術(shù)飲片中姜黃素、雙去甲氧基姜黃素和去甲氧基姜黃素的含量

高紅寧 殷 奕 毛春芹 陸兔林

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京 210046；2.南京多康商貿(mào)有限公司，江蘇南京 210000

中藥莪術(shù)為姜科植物溫郁金C.wenyujin Y.H.Chen et C.Ling、廣西莪術(shù)C.kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang和蓬莪術(shù)C.phaeocaulis Valeton的干燥根莖，味辛、苦，性溫，歸肝、脾經(jīng)，具有消積止痛、行氣破血的功效[1]。莪術(shù)主要有效成分為揮發(fā)油和姜黃素類(lèi)[2-11]。其中姜黃素類(lèi)成分主要為姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素。姜黃素、去甲氧基姜黃素和雙去甲氧基姜黃素具有明顯的體外抗凝血與抗血栓的活性[12-16]。在中醫(yī)臨床上應(yīng)用較多的是醋莪術(shù)飲片，但有關(guān)醋莪術(shù)飲片的研究報(bào)道較少；本實(shí)驗(yàn)首次對(duì)醋莪術(shù)飲片中姜黃素、雙去甲氧基姜黃素和去甲氧基姜黃素的含量進(jìn)行同時(shí)測(cè)定，能更好地控制醋莪術(shù)飲片質(zhì)量，可為制定醋莪術(shù)飲片質(zhì)標(biāo)提供技術(shù)手段。

1 材料

1.1 儀器

1100 型HPLC 儀（美國(guó)安捷倫公司）；KH-300DB 型超聲清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；Mettler AG285 電子分析天平 （瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)）；FA210N 電子天平（上饒市鴻翔實(shí)業(yè)有限公司）；40-B型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（常州邁順機(jī)械有限公司）。

1.2 試藥

姜黃素對(duì)照品（DST180111-014）；去甲氧基姜黃素對(duì)照品（DST181220-030）；雙去甲氧基姜黃素對(duì)照品（DST181220-021）；以上對(duì)照品均購(gòu)自成都德斯特生物技術(shù)有限公司。莪術(shù)樣品購(gòu)自我國(guó)廣西省、浙江省、四川省，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院潘金火教授鑒定為姜科植物溫郁金C.wenyujin Y.H.Chen et C.Ling、廣西莪術(shù)C.kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang和蓬莪術(shù)C.phaeocaulis Valeton的 干燥根莖。取各產(chǎn)地莪術(shù)樣品按《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版[1]莪術(shù)項(xiàng)下自制得醋莪術(shù)飲片。表1 為莪術(shù)樣品批號(hào)、產(chǎn)地和來(lái)源。甲酸、乙腈為色譜純（美國(guó)Fish 公司），其他溶劑均為分析純。

表1 莪術(shù)批號(hào)產(chǎn)地和來(lái)源

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent pro shell C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相： 0.5‰甲酸水（A）-0.5‰甲酸乙腈（B），梯度洗脫：0～10 min，65%～55%A；10～20 min，55%～30%A；20～25 min，30%～5%A；25～30 min，5%A；30～35 min，5%～60%A；35～40 min，60%A；流速：1.0 ml/min；進(jìn)樣量：10 μl；檢測(cè)波長(zhǎng)：415 nm；柱溫：30℃。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液的配制 取3 種對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，置于同一5 ml 量瓶中，加甲醇溶解定容，制得含姜黃素0.071 mg/ml、去甲氧基姜黃素0.051 mg/ml、雙去甲氧基姜黃素0.011 mg/ml 的混合對(duì)照品貯備液。

2.2.2 供試品溶液的配制 精密稱(chēng)定0.5 g 醋莪術(shù)飲片粉末，置于50 ml 量瓶中，加入20 ml 70%乙醇，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲提取30 min，補(bǔ)足減失質(zhì)量，用微孔濾膜（孔徑為0.45 μm）過(guò)濾，所得的濾液作為供試品溶液。

2.3 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

取供試品溶液、混合對(duì)照品貯備液，按上述色譜條件測(cè)定進(jìn)樣，記錄色譜，詳見(jiàn)圖1，由圖1 可知，姜黃素、去甲氧基姜黃素和雙去甲氧基姜黃素分離良好，在各出峰處均無(wú)干擾，表明該方法的專(zhuān)屬性良好。

圖1 高效液相色譜圖

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及線(xiàn)性范圍

精密吸取混合對(duì)照品貯備液0.1、0.2、0.5、1.0、2.5 ml，分別置于5 ml 量瓶?jī)?nèi)，加甲醇稀釋至刻度，分別精密吸取10 μl 注入HPLC 儀，按上述色譜條件測(cè)定，記錄峰面積。以峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，對(duì)照品質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得到各對(duì)照品線(xiàn)性方程、相關(guān)系數(shù)及線(xiàn)性范圍見(jiàn)表2。

表2 對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)、相關(guān)系數(shù)及線(xiàn)性范圍

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液按上述色譜條件，于1 d連續(xù)進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果顯示姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素的峰面積RSD值分別為0.61%、1.13%、0.94%。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h 時(shí)，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素峰面積的RSD 分別為0.3%、0.8%、0.6%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取批號(hào)為SC180211 的醋莪術(shù)飲片粉末0.5 g，共6 份，精密稱(chēng)定，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素的RSD 值，結(jié)果分別為1.0%、1.8%、1.0%。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取批號(hào)為SC180211 的醋莪術(shù)飲片粉末0.25 g，精密稱(chēng)定，共9 份，置于具塞錐形瓶中，分別加入低、中、高3 個(gè)質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液0.8、1.0、1.2 ml，按“2.2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素的平均回收率分別為99.2%、97.7%、96.9%，RSD 分別為1.0%、1.2%、1.9%。

2.9 樣品含量測(cè)定

取不同產(chǎn)地的醋莪術(shù)飲片適量，粉碎，過(guò)三號(hào)篩，取粉末0.5 g，精密稱(chēng)定，按“2.2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，再按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定3 種成分的量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同產(chǎn)地醋莪術(shù)中各成分的含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

3 討論

3.1 色譜柱選擇

本實(shí)驗(yàn)考察了Agilent pro shell C18色譜柱和Kromasi C18色譜柱，發(fā)現(xiàn)采用Agilent pro shell C18色譜柱，3 種成分均能出峰，各峰間分離度、對(duì)稱(chēng)性好，分離效果為佳。

3.2 色譜條件選擇

本研究依次考察了乙腈-水、乙腈-甲酸水、甲酸乙腈-甲酸水，結(jié)果表明0.5‰甲酸水（A）-0.5‰甲酸乙腈（B），0～10 min，65%～55A；10～20 min，55%～30%A；20～25 min，30～5%A；25～30 min，5%A；30～35 min，5%～60%A；35～40 min，60%A；流速1.0 ml/min；柱溫30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)415 nm時(shí)分離效果最佳。

3.3 提取條件選擇

在選擇供試品提取方法時(shí)，考察了乙醇回流提取法和乙醇超聲提取法，發(fā)現(xiàn)兩者的提取效率接近，但乙醇超聲提取節(jié)省時(shí)間，操作簡(jiǎn)便，故選擇乙醇超聲提取法。在乙醇超聲提取的基礎(chǔ)上，分別考察50%、60%、70%、80%乙醇不同提取溶劑；30、40、50、60 min 不同提取時(shí)間；25、40、55、70 倍量液料比，確定最佳提取方法為70%乙醇40 倍量超聲提取30 min。

表3 結(jié)果表明，不同產(chǎn)地醋莪術(shù)中姜黃素、雙去甲氧基姜黃素和去甲氧基姜黃素的含量存在差異，總體上四川產(chǎn)醋莪術(shù)中姜黃素、雙去甲氧基姜黃素和去甲氧基姜黃素含量較高，浙江產(chǎn)醋莪術(shù)中未檢出雙去甲氧基姜黃素，姜黃素和去甲氧基姜黃素含量次之，而在廣西產(chǎn)醋莪術(shù)中測(cè)不到姜黃素、雙去甲氧基姜黃素和去甲氧基姜黃素含量。同產(chǎn)地不同時(shí)期醋莪術(shù)中姜黃素、雙去甲氧基姜黃素和去甲氧基姜黃素的含量也有差別，這可能與氣候、光照、溫度、降雨量及加工方法等因素有關(guān)，或由于本實(shí)驗(yàn)收集批次較少，樣品存在差異所致。相關(guān)研究有待于進(jìn)一步開(kāi)展。

本研究建立了HPLC 法測(cè)定不同產(chǎn)地醋莪術(shù)飲片中姜黃素、雙去甲氧基姜黃素和去甲氧基姜黃素的含量方法，確定以70%乙醇為提取液，40 倍量超聲提取 30 min，色譜柱為Agilent pro shell C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為0.5‰甲酸水-0.5‰甲酸乙腈，梯度洗脫；流速1 ml/min；柱溫30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)415 nm；進(jìn)樣量10 μl。姜黃素、雙去甲氧基姜黃素和去甲氧基姜黃素分別在1.42～71.00、0.22～10.82、1.01～50.50 μg/ml 時(shí)與色譜峰面積線(xiàn)性關(guān)系良好，平均回收率分別為99.2%、96.9%、97.7%，RSD 分別為1.0%、1.9%、1.2%，該方法準(zhǔn)確、靈敏。

目前在中醫(yī)臨床上應(yīng)用較多的是醋莪術(shù)飲片，但有關(guān)醋莪術(shù)飲片的研究報(bào)道較少，對(duì)莪術(shù)的研究多集中在生藥、生飲片和揮發(fā)油方面，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC 法梯度洗脫首次對(duì)醋莪術(shù)飲片中姜黃素、雙去甲氧基姜黃素和去甲氧基姜黃素的含量進(jìn)行同時(shí)測(cè)定，并對(duì)不同產(chǎn)地醋莪術(shù)中姜黃素、雙去甲氧基姜黃素和去甲氧基姜黃素的含量進(jìn)行比較，實(shí)驗(yàn)方法準(zhǔn)確、快速、重復(fù)性好，可作為評(píng)價(jià)醋莪術(shù)中姜黃素、雙去甲氧基姜黃素和去甲氧基姜黃素等成分的可靠分析方法，能更好地控制醋莪術(shù)飲片質(zhì)量，旨在為制定醋莪術(shù)飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供理論依據(jù)。