實時熒光定量PCR檢測九香蟲血淋巴液對腫瘤細胞凋亡相關基因表達的影響

楊佳琪段小鳳徐小茜田建霞郭建軍

(1.銅仁職業技術學院，貴州 銅仁 554300；2. 貴州大學昆蟲研究所/貴州山地農業病蟲害重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

九香蟲作為傳統藥用昆蟲已多次出現在臨床藥用上，近年來其對腫瘤細胞特有的功效引發學者們研究熱潮，諸多學者對九香蟲引起腫瘤細胞凋亡進行研究，結果證明，九香蟲可引起腫瘤細胞凋亡，但其作用機制仍需進行試驗研究[1,2]。故本試驗采用特異性強以及靈敏性較好的熒光定量PCR方法從mRNA上檢測九香蟲血淋巴液作用于腫瘤細胞以后凋亡相關的基因表達，以此探究九香蟲血淋巴液引起腫瘤凋亡的機制。

1 試驗材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

主要儀器與試劑見表1。

表1 主要儀器與試劑

1.2 試驗方法

1.2.1 供試細胞的處理

分別培養人胃癌SGC-7901細胞與人乳腺癌MCF-7細胞至指數生長期，采取倍比稀釋方法，使得2種細胞濃度至107個·mL-1。具體處理濃度及加樣體積見表2，放置二氧化碳培養箱中培養24h，利用0.25%的胰酶進行消化后，使用PBS緩沖液洗滌腫瘤細胞2遍。

表2 九香蟲血淋巴處理

1.2.2 制備RNA及測定其濃度

利用TRIzol方法制取腫瘤細胞RNA，并對RNA完整性進行測定，條件控制設定為110V，20min。

1.2.3 引物設計及合成

選用life technology公司設計與合成的引物，見表3。

表3 引物

1.2.4 去基因組DNA和cDNA的合成

按照表2中順序于冰上進行基因組DNA的反應液配置操作，將PCR儀條件設為42℃,2min，而后終止反應，于4℃的冰上驟冷,反應條件見表4。

表4 去基因組DNA反應(10μL體系)

按照表5中順序于冰上進行反轉錄的反應液配置，PCR儀條件控制為37℃、15min，而后85℃、5s進行反轉錄聚合酶的滅活，最后使反應終止，放于4℃的冰水進行驟冷，反應條件見表6。利用RNase-free Water使cDNA稀釋5倍，-20℃進行保存。

表5 反應條件

表6 反轉錄(20μL體系)

1.2.5 實時熒光定量PCR

各個樣本的對應目的基因及內參基因重復3孔。按照表7中順序進行試劑的配置，反應條件可見表8。

表7 反應條件

表8 熒光定量PCR的操作體系(20μL)

表9 反應條件

2 結果與分析

2.1 RNA電泳圖及RNA濃度測定

根據表10樣品順序上樣，方法選用瓊脂糖凝膠電泳(DL2000 Marker)，圖1所示18s條帶及28s條帶明顯，5s較為模糊，從而確定RNA完整性的檢測結果合格。將提取的完整RNA進行DNaseI處理后，利用PCR擴增測定所獲取的RNA不存在污染，能用于后續試驗。

表10 凝膠電泳樣品順序

2.2 溶解曲線

由圖2的溶解曲線可看出，該PCR產物的引物特異性相對較好；圖3的擴增曲線顯示PCR擴增反應的特異性。

2.3 各樣品相關凋亡基因的表達

采用實時熒光定量PCR方法對2種腫瘤細胞凋亡相關基因進行檢測，了解其變化，結果以RQ(2-△△Ct)進行表示，結果見圖4。經血淋巴液處理后的2種腫瘤細胞Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9與Bax基因mRNA表達較CK組顯著上調，而Bcl-2基因的表達較CK組顯著下調。另由圖4可見，當血淋巴液濃度為2.65mg·L-1時，Caspase-8的表達比濃度為12.26mg·L-1時低；當血淋巴液的濃度為12.26mg·L-1，Caspase-8的表達和CK組結果更為接近，但僅從表11的結果，不能排除可能經過外源性凋亡通路及內源性凋亡通路的相互作用，從而使腫瘤細胞走向凋亡，后續仍需針對血淋巴液誘導腫瘤細胞凋亡機制進行深入研究[3-5]。

表11 相關凋亡基因數據處理