miR-495-3p聯合黃氏總皂苷對高糖誘導的成骨細胞增殖、凋亡的影響及其機制研究

劉亞東，盧小偉

作者單位：湖北醫藥學院附屬東風醫院骨外科，湖北 十堰442000

骨質疏松癥是中老年人最常見的骨科疾病，隨著中國社會老齡化，骨質疏松癥發病率逐步上升，而骨折是最常見也是最嚴重的并發癥。糖尿病性骨質疏松癥（Diabetic osteoporosis，DOP）是糖尿病的并發癥之一，以糖尿病為特征，伴隨著骨量減少、骨組織微結構改變、骨強度降低和骨脆性增加。DOP是一種繼發性骨質疏松癥，2型糖尿病被認為骨質疏松癥相關骨折的危險因素。目前，DOP的發病機制尚不清楚。既往研究表明，高糖環境下，成骨細胞的增殖受抑制，凋亡率明顯升高。黃芪總皂苷（Total saponins of Astragalus membranaceus，TSA）是黃芪主要的活性成分之一，現階段已分離得到包括黃芪皂苷Ⅰ-Ⅷ在內的40多種三萜皂苷類成分。資料顯示，TSA可促進小腸上皮細胞、神經干細胞NSCs的增殖。由黃芪等藥材制成的黃芪散可以促進高糖作用下的成骨細胞增殖。黃芪注射劑可以明顯提高22例DOP病人的骨密度，取得較好療效。然而，TSA 作用于DOP的研究鮮見報道。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類高度保守的非編碼RNA。報道指出，微小RNA-495-3p（miR-495-3p）通過調節胃癌發生過程中的多種表觀遺傳修飾因子起到腫瘤抑制劑的作用，脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）處理顯著下調人牙周膜細胞這miR-495-3p 表達，但miR-495-3p對成骨細胞的作用尚不明確。因此，2018年2月至2019年4月，本研究利用高糖誘導商購小鼠的細胞MC3T3-E1構建DOP模型，觀察黃芪總皂苷對高糖培養的MC3T3-E1細胞增殖、凋亡的影響，并結合miR-495-3p探尋其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗主要試劑

小鼠成骨細胞系MC3T3-E1購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心，黃芪總皂苷（純度≥98%）購自源葉生物公司，DMEM 培養基、胎牛血清購自美國Hyclone公司，葡萄糖、噻唑藍（Methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、二甲基亞砜（Dimethyl sulphoxide，DMSO）購自美國Sigma 公司，RIPA 裂解液購自美國Millipore 公司，miRNA 提取試劑盒購自上海Qiagen公司，Tris-HCl-Tween緩沖鹽溶液（Tris buffered saline with Tween，TBST）購自上海生工生物工程公司，胰酶、凋亡試劑盒購自上海碧云天生物有限公司，逆轉錄試劑盒、實時定量PCR（Quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒購自美國應用生物系統公司，Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司，β肌動蛋白（β-actin）抗體、細胞周期蛋白D1（CyclinD1）、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleave-caspase-3）抗體購自美國Cellular Signaling Technology 公司，辣根過氧化物酶標記二抗購自武漢博士德生物有限公司。

1.2 細胞培養、細胞轉染及分組

MC3T3-E1細胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養液，于37 ℃、5%二氧化碳培養箱中培養。每周換液2～3次，胰酶消化后進行接種傳代。轉染時，以1×10個/mL的細胞密度接種于6孔板，待其生長至80%融合度時，嚴格按照Lipofectamine 2000 試劑說明書進行，將miR-495-3p、抗miR-495-3p（anti-miR-495-3p）及各自陰性對照轉染入MC3T3-E1細胞，轉染穩定后收集細胞用于后續實驗。

細胞用隨機數表法隨機分為對照（NC）組（MC3T3-E1 細胞），高糖組（30 mmol/L 葡萄糖+MC3T3-E1細胞），高糖+不同濃度TSA 組（高糖+0.5、1.0、2.0、5.0、10 μg/mL TSA+MC3T3-E1 細胞），高糖+miRNA陰性對照（miR-con）組（高糖+轉染miR-con），高糖+miR-495-3p組（高糖+轉染miR-495-3p），高糖+TSA+抗miRNA陰性對照（anti-miR-con）組（高糖+2.0 μg/mL TSA+轉染anti-miR-con），高糖+TSA+anti-miR-495-3p（高糖+2.0 μg/mL TSA+轉染anti- miR-495-3p）。其中，TSA作用時間為48 h。

1.3 MTT法檢測細胞增殖

收集各組MC3T3-E1細胞，加入胰酶消化，以1×10個/孔的細胞密度接種于96孔板，培養48 h，加入5 mg/mL的MTT溶液100 μL，37 ℃孵育4 h，棄上清液，加入DMSO 200 μL，37 ℃搖床孵育10 min，于酶標儀測定細胞490 nm 波長處吸光度值（OD值），根據公式計算細胞存活率。細胞存活率（%）=實驗組OD/對照組OD×100%

1.4 細胞凋亡實驗

胰酶消化各組MC3T3-E1細胞，以5×10個/mL，加入500 μL Annexin V緩沖液重懸細胞，隨后將細胞轉移至EP管，在室溫黑暗條件下用5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI 孵育30min，上流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.5 qRT

-

PCR 檢測miR

-

495

-

3p 的表達水平

利用miRNA 提取試劑盒提取MC3T3-E1 細胞中總miRNA，根據逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA。以制成的cDNA 為模板，U6 為參照，進行qRT-PCR 反應。miR-495-3p 正向引物序列為5'-TCAATAAATTTGGTGGTCCTCGG-3'，反向引物序列為5'-TAGGCCTTGCACGAAGATGG-3'。反應結束后，收集Ct值，以2法分析miR-495-3p相對表達量。

1.6 Western blotting 檢

測CyclinD1、Cleave

-

cas

pase

-

3蛋白表達

在各組細胞中加入RIPA裂解液，充分提取總蛋白，10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）分離蛋白，之后將蛋白轉移到聚偏二氟乙烯（Polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，在5%脫脂奶粉中封閉1 h。加入一抗（1∶1 000稀釋）4 ℃孵育過夜，TBST充分洗膜后與二抗（1∶5000稀釋）室溫孵育1h，加入TBST充分洗膜。置于化學發光液中顯色、顯影，以β-actin為參照，分析CyclinD1、Cleave-caspase-3相對表達量。

2 結果

2.1 不同濃度TSA對成骨細胞MC3T3

-

E1（高糖）增殖的影響

MTT檢測結果顯示，與NC細胞組比較，高糖組MC3T3-E1細胞存活率大幅減少（

P

＜0.05）。與高糖細胞組比較，高糖與0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10 μg/mL 濃度TSA 組MC3T3-E1細胞存活率明顯升高，并呈劑量依賴性（

P

＜0.05）。后續實驗選擇2.0 μg/mL的TSA濃度進行相關研究。見表1。

表1 不同濃度TSA抑制成骨細胞MC3T3-E1（高糖）增殖/（%，±s）

2.2 TSA對成骨細胞MC3T3

-

E1（高糖）凋亡的影響及qRT

-

PCR檢測miR

-

495

-

3p的表達水平

流式細胞儀檢測結果顯示，相比于NC細胞組，高糖組MC3T3-E1細胞凋亡率顯著升高（

P

＜0.05）。相比于高糖細胞組，高糖與2.0 μg/mL TSA組明顯減少MC3T3-E1細胞凋亡率（

P

＜0.05）。Western blotting檢測結果表明，與NC細胞組比較，高糖顯著增加MC3T3-E1細胞Cleavecaspase-3表達量（

P

＜0.05）。與高糖細胞組比較，高糖與2.0 μg/mL TSA組顯著降低MC3T3-E1細胞Cleavecaspase-3蛋白水平（

P

＜0.05）。qRT-PCR 檢測結果顯示，與NC細胞組相比，高糖組MC3T3-E1細胞中miR-495-3p 表達量大幅減少（

P

＜0.05）。與高糖細胞組相比，高糖與2.0 μg/mL TSA組明顯增加MC3T3-E1細胞中miR-495-3p表達量（

P

＜0.05）。見表2，圖1，。

表2 TSA對成骨細胞MC3T3-E1（高糖）凋亡的影響/±s

圖1 TSA對成骨細胞MC3T3-E1（高糖）凋亡的影響：A為Western blotting檢測Cleave-caspase-3蛋白表達；B為流式細胞儀檢測細胞凋亡

2.3 miR

-

495

-

3p 促進成骨細胞MC3T3

-

E1（高糖）增殖，抑制凋亡

與NC 細胞組比較，高糖明顯降低MC3T3-E1 細胞存活率、miR-495-3p、CyclinD1 表達量，提高細胞凋亡率和Cleave-caspase-3 水平，均差異有統計學意義（

P

＜0.05）。與高糖+miR-con 組比較，過表達miR-495-3p 明顯提高高糖誘導的MC3T3-E1 細胞存活率、miR-495-3p、CyclinD1 表達量，降低細胞凋亡率和Cleave-caspase-3 水平，均差異有統計學意義（

P

＜0.05）。見表3，圖2。

2.4 低表達miR

-

495

-

3p 可以逆轉TSA 對成骨細胞MC3T3

-

E1（高糖）增殖和凋亡的影響研究

高糖與2.0 μg/mL TSA 組明顯提高MC3T3-E1 細胞存活率、miR-495-3p、CyclinD1 水平，顯著降低細胞凋亡率和Cleave-caspase-3表達量（

P

＜0.05）。與高糖+TSA+anti-miR-con 組相比，高糖、2.0 μg/mL TSA 和轉染antimiR-495-3p組顯著降低MC3T3-E1細胞存活率、miR-495-3p 和CyclinD1 表達量，明顯提高細胞凋亡率和Cleave-caspase-3水平（

P

＜0.05）。見圖3，表4。

3 討論

本研究以高糖誘導成骨細胞損傷，這種模型構建方式前人早有報道。吳娟等發現高糖高脂以時間依賴方式抑制成骨細胞增殖活性，促進細胞凋亡并上調cleaved caspase-3 表達。顏曉芳等指出間歇性高糖明顯降低成骨細胞中CyclinD1 及β-連環蛋白（β-catenin）、骨形態發生蛋白-2（BMP-2）水平。本研究中，高糖明顯減少MC3T3-E1 細胞存活率和CyclinD1 表達量，增加細胞凋亡率和Cleavecaspase-3表達（

P

＜0.05），這與上述研究一致。

表3 miR-495-3p促進成骨細胞MC3T3-E1（高糖）增殖，抑制凋亡/±s

表4 低表達miR-495-3p可以逆轉TSA對成骨細胞MC3T3-E1（高糖）增殖和凋亡的影響研究/±s

圖2 Western blotting檢測過表達miR-495-3p對高糖誘導CyclinD1和Cleave-caspase-3的影響

圖3 低表達miR-495-3p可以逆轉TSA對成骨細胞MC3T3-E1（高糖）增殖和凋亡的影響（Western blotting檢測）

黃芪總皂苷TSA 從藥用植物黃芪提取而來，是黃芪主要的活性成分，對各種類型的癌癥表現出抗腫瘤能力，還具有降血糖、抗炎、抗病毒、抗氧化和免疫調節等活性。黃芪可以改善血糖水平，在糖尿病及其并發癥治療中擁有廣泛的應用前景。不同配比的黃芪總皂苷和姜黃素聯用對糖尿病模型大鼠具有良好的治療效果。以往的資料顯示，黃芪提取物或多糖對成骨細胞具有一定調節能力，可有效緩解大鼠卵巢切除誘導的骨質疏松癥。黃芪甲苷I刺激成骨細胞MC3T3-E1中β-連環蛋白和Runt家族相關轉錄因子2的表達，通過Wnt/β-連環蛋白信號通路刺激成骨細胞分化。大鼠成骨細胞加入不同體積分數的黃芪注射液分別培養3、5、7、9天，成骨細胞的增殖能力得到顯著促進，并呈現量效趨勢。黃芪甲苷IV 可作為促進骨整合的生長因子，激活Hedgehog信號通路并顯著促進人成骨細胞樣細胞增殖和遷移。然而TSA對高糖培養成骨細胞增殖和凋亡的影響尚未可知。本實驗中，TSA 明顯增加高糖誘導的MC3T3-E1細胞存活率和CyclinD1蛋白表達量，降低MC3T3-E1細胞凋亡率和Cleave-caspase-3水平，提示黃芪總皂苷可以改善高糖誘導的成骨細胞損傷，促進高糖誘導的成骨細胞增殖并抑制其凋亡，與前人對黃芪及其皂苷促進成骨細胞增殖作用相符。

miRNA 是一種短鏈非編碼RNA，其通過引起靶mRNA 的降解或翻譯抑制來調節轉錄后的基因表達。已有證據表明，miRNA參與高糖刺激的成骨細胞分化過 程，例 如miR-335-5p，miR-424，miR-449。研究發現，miR-590-5p 過表達減弱高糖對MC3T3-E1生長的抑制作用，顯著促進成骨細胞生長和分化。然而，miR-495-3p是否會影響高糖條件下MC3T3-E1細胞生長仍然知之甚少。本研究中，高糖刺激MC3T3-E1 細胞，導致miR-495-3p 表達量減少，這說明在高糖條件下，miR-495-3p可能在成骨細胞功能中起重要作用。過表達miR-495-3p顯著提高高糖誘導的MC3T3-E1細胞存活率、CyclinD1表達量，降低細胞凋亡率和Cleave-caspase-3 水平，證明miR-495-3p促進高糖誘導的成骨細胞增殖并抑制其凋亡，這與黃芪總皂苷的效果相似。在MC3T3-E1 細胞中轉染anti-miR-495-3p，進一步考察TSA保護高糖損傷成骨細胞的機制，發現低表達miR-495-3p可以逆轉TSA促進高糖誘導的MC3T3-E1 增殖作用和抑制其凋亡作用，表明調控miR-495-3p可能是黃芪總皂苷發揮保護高糖損傷成骨細胞功能的重要機制之一。

綜上所述，黃芪總皂苷可以改善高糖誘導的成骨細胞損傷，抑制其增殖并誘導凋亡，其作用機制與調控miR-495-3p 表達有關，這為理解糖尿病性骨質疏松癥的機制提供了理論基礎，也為黃芪的開發和臨床應用提供了新思路。但是關于黃芪總皂苷保護高糖損傷成骨細胞的具體機制有待于進一步探索。