血清微小RNA-200C、微小RNA-101、肝腸鈣黏蛋白和糖類抗原72-4聯合檢測對胃癌的診斷價值

王曉陽，謝愛敏，郎少磊

作者單位：三門峽市中心醫院醫學檢驗科，河南 三門峽472000

胃癌是臨床多發且死亡率居高不下的惡性腫瘤，早期胃癌手術治療預后較好，但晚期胃癌5年生存率僅為24%，因此胃癌的早期診斷是減少其死亡率的關鍵。目前胃內鏡檢查是胃癌診斷的可靠工具，但其價格昂貴且具有一定侵入性，在胃癌的一線篩查應用中受限。血清學標志物檢測因其方便、無創等優點被逐漸用于癌癥的早期診斷及篩查中，但目前常見的血清腫瘤標志物診斷靈敏度及特異度較低，亟需尋找更有效的胃癌診斷標志物或方法。胃癌的發生及發展是多因素共同作用的復雜過程，其中遺傳因素及環境因素發揮重要作用。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類非編碼RNA，在細胞分化、發育、增殖及凋亡中均發揮重要功能。微小RNA-200C（microRNA-200C，miR-200C）、微小RNA-101（microRNA-101，miR-101）是已在惡性腫瘤方面有一定研究基礎的miRNA，大量研究表明其可調節上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）過程，參與腫瘤增殖、侵襲、轉移等惡性生物學行為過程。除miRNA，部分決定組織生物學特性的分子也在腫瘤的發生及發展中發揮重要作用，肝腸鈣黏蛋白（enterohepatic cadherin，CDH17）是近年來發現的鈣黏蛋白超家族成員，與細胞黏附及EMT作用相關，在維持腸道上皮細胞完整性方面發揮一定作用，與胃癌的發生及發展有一定關系。目前已有部分研究開展了胃癌病人血清miR-200C、miR-101、CDH17等因子變化的研究，但這些因子對胃癌的診斷價值仍有待大樣本數據支持。本研究比較了胃癌、胃良性疾病病人及健康受試者miR-200C、miR-101、CDH17差異，分析其診斷價值，并與糖類抗原72-4（carbohydrate antigen72-4，CA72-4）等常見標志物診斷價值進行比較，并探討多指標聯合診斷的可行性，旨在為胃癌的早期準確診斷提供參考。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2017年1月至2019年2月三門峽市中心醫院收治的150 例胃癌病人納入胃癌組，所有病人均經病理檢查確診，排除合并全身系統性疾病、其他良惡性腫瘤者及已接受放化療等輔助治療措施者。另選擇該院同期收治的50 例胃良性疾病病人及50例健康體檢者，分別納入良性組及對照組，其中胃良性疾病者為經胃鏡檢查確診的慢性萎縮性胃炎、胃息肉、胃潰瘍病人，健康體檢者經完整的體格檢查、實驗室檢查，排除其他系統疾病及良惡性腫瘤。經比較，三組受試者性別組成、年齡比較差異無統計學意義（

P

＞0.05），見表1。

表1 胃癌病人150例、胃良性疾病50例及健康體檢者50例一般資料比較

1.2 方法

實時熒光定量-反轉錄聚合酶鏈式反應（RT-qPCR）檢測miR-200C、miR-101表達：①總RNA提取。采集病人外周靜脈血，離心分離血清，吸取上清保存備用。取200 μL 血清置于1.5 mL 離心管內，采用Trizol 試劑提取RNA，DEPC 水溶解，采用1%甲醛變性膠檢測RNA 完整性及質量，保存備用。②逆轉錄實驗。采用micro RNA 逆轉錄試劑盒，反應體系為20 μL：10×RT buffer 1.5 μL，100 mmol/L dNTPs 0.15 μL，50 U/μL Reverse Transcriptase 1.0 μL，20 U/μL RNA 酶抑制劑0.19 μL，1 μmol/L 逆轉錄特異性引物3 μL，RNA 模板1 μL，DEPC 水補足。③PCR 反應。反應體系為20 μL：TaqMan GE MASTER Mix 10 μL、RT 產物1 μL、RT 特異性引物1μl、補DEPC 水至20 μL。反應條件：95 ℃10 min；95 ℃15 s，60 ℃1 min，40 Cycle。miR-200C 特異性引物：正向引物（TCCTTCATTCCACCGGAGTCTG），反向引物（GCGAGCACAGAATTAATACGAC）。miR-101 特異性引物：正向引物（TGGGCTACAGTACTGTGATA）；反向引物（TGCGTGTCGTGGAGTC）。內參U6特異性引物：正向引物（5’-CATTGCACTTGTCTCGGTCT-3’）；反向引物（5’-GGTCCGAGGTATTCGCACT-3’）。④結果計算：以U6 擴增作為參照，測定循環閾值（Ct 值），計算ΔCt 值，ΔCt=目的擴增Ct 值-內參Ct值，以2表示為目的產物的表達水平。

CDH17 和CA72-4 濃度檢測：采用酶聯免疫吸附法檢測血清CDH17濃度，實驗試劑盒購自北京博奧森生物科技有限公司；CA72-4采用電化學發光免疫分析法測定，試劑購自羅氏公司。

2 結果

2.1 各組受試者血清miR

-

200C、miR

-

101、CDH17、CA72

-

4 表達情況

各組血清miR-200C、miR-101、CDH17、CA72-4 表達水平差異統計學意義（

P

＜0.05），胃癌組病人血清miR-200C、miR-101 表達水平顯著低于良性組及對照組，CDH17、CA72-4 水平顯著高于良性組及對照組（

P

＜0.05）。見表2。

表2 胃癌病人150例、胃良性疾病50例及健康體檢者50例血清miR-200C、miR-101、CDH17、CA72-4表達情況比較

2.2 血清miR-200C、miR-101、CDH17、CA72-4表達水平與胃癌病理參數之間的關系

血清miR-200C、miR-101、CDH17 與胃癌病人浸潤深度、淋巴結轉移、脈管浸潤、臨床分期相關（

P

＜0.05）；CA72-4與胃癌病人淋巴結轉移相關（

P

＜0.05）。具體結果見表3。

2.3 血清學指標單獨用于胃癌診斷的價值分析

各腫瘤標志物單獨診斷胃癌，miR-200C、miR-101、CDH17 及CA72-4 診斷胃癌的曲線下面積分別為0.899、0.904、0.871、0.793；其中miR-101 診斷曲線下面積最大，當截點值為0.46 時，其診斷靈敏度、特異度分別為82.3%、82.1%。詳見圖1、表4。

圖1 各腫瘤標志物單獨診斷胃癌的ROC曲線

表4 各腫瘤標志物單獨診斷胃癌的診斷效能

2.4 血清學指標聯合診斷胃癌的價值分析

miR-200C、miR-101、CDH17 分別聯合CA72-4 診斷胃癌的曲線下面積為0.956、0.947、0.961，四種聯合診斷曲線下面積最大，其靈敏度、特異度分別為97.6%、90.6%。詳見圖2、表5。

圖2 血清學指標聯合診斷胃癌的ROC曲線

表5 不同指標組合對胃癌的診斷效能分析

3 討論

研究證實，miRNA 可通過與靶基因3’非編碼區或開放閱讀框互補結合，調節目的基因的轉錄從而調節表達；在腫瘤方面，miRNA 與多種原癌基因、抑癌基因表達相關，可影響腫瘤的產生及發展。miR-200C、miR-101 為抑癌基因的miRNA，miRNA-200C是存在于多種腫瘤組織及細胞的miRNA，研究報道其在消化道癌、乳腺癌等諸多腫瘤組織中均存在異常表達。miRNA-101 的成熟形式由miRNA-101-1 及miRNA-101-2 兩種形式構成，研究表明其可參與EMT 過程，EMT 的發生導致鈣黏附蛋白E表達下調，減少細胞間的黏附，加速癌細胞的擴散及侵襲；miRNA-101 的低表達也可促進EZH2 表達升高，導致鈣黏蛋白E 表達通路障礙。Lv 等開展的一項研究證實，肺癌組織miRNA-101 表達缺失時，也導致COX-2 等基因的高表達，促進癌細胞血管生成，促進其進展。EMT 的激活與腫瘤發生、侵襲性密切相關，EMT 相關調節因子可能可為惡性腫瘤的診斷提供一定參考。CDH17為鈣黏蛋白家族成員，雖然與其他成員有結構及功能上的區別，但其也與胚胎的發生、發育及器官形成、維持等過程密切相關。既往一項基因芯片及表達分析技術研究顯示，胃癌病人中CDH17 RNA 表達可出現顯著性上調。本研究結果顯示，與對照組及良性組比較，胃癌病人血清miRNA-200C、miRNA-101 水平較低，CDH17 水平較高，且其表達程度與胃癌病人臨床病理參數相關，浸潤程度越高、伴有淋巴結轉移的病人miRNA-200C、miRNA-101 水平更低，CDH17 水平更高，提示miRNA-200C、miRNA-101 可能參與胃癌的發生及發展過程。

表3 胃癌病人150例血清miR-200C、miR-101、CDH17、CA72-4表達水平與胃癌病理參數之間的關系

目前miR-200C、miR-101、CDH17 在胃癌中的表達量已有部分研究報道，但各指標對胃癌的診斷價值研究報道較少，加之各研究檢測方法差異及納入對象的差異，各研究得到的診斷截點值及診斷效能有較大差異。本研究將這3種相對新穎的指標與臨床常見的血清腫瘤標志物CA72-4的診斷價值進行比較，結果顯示，三者診斷胃癌的曲線下面積為0.899、0.904、0.871，高于CA72-4 診斷（0.793），提示這三種標志物可能對于胃癌有更高的診斷效能。另外本研究探討了miR-200C、miR-101、CDH17分別與CA72-4聯合及多者聯合診斷的價值，結果顯示miR-200C、miR-101、CDH17 分別聯合CA72-4 診斷胃癌的曲線下面積為0.956、0.947、0.961，四種聯合診斷曲線下面積最大，曲線下面積高達0.995，提示多者聯合可提高胃癌的診斷效能。考慮到臨床檢測miR-200C、miR-101過程復雜，多種指標聯合用于篩查可能較為困難，臨床上可選用兩種指標聯合提高疾病的診斷。

綜上所述，miR-200C、miR-101、CDH17、CA72-4對胃癌有一定診斷效能，相比于常見腫瘤標志物CA72-4，miR-200C、miR-101、CDH17診斷價值更高，臨床上可通過聯合多種指標共同診斷以提高診斷準確度；盡管血清學指標對于胃癌有一定診斷價值，但其仍存在較多誤診漏診，僅具有初篩價值，在臨床上宜結合臨床癥狀、內鏡檢查方式，對于可疑病例最終應以病理學診斷為準。