敲低Ⅰ型膠原α1鏈基因抑制鼻咽癌細胞增殖、遷移和侵襲的研究

馬永紅，同娟

作者單位：寶雞市中心醫院耳鼻喉科，陜西 寶雞721000

鼻咽癌是一種發病率較高的常見頭頸部腫瘤，其死亡率居于頭頸部惡性腫瘤的前列。在我國，南方鼻咽癌的發病率高于北方，每年新增病人占全世界鼻咽癌新增病例的一半以上。鼻咽癌具有發病隱匿、轉移性強等臨床特點。目前，臨床常采用放化療結合治療鼻咽癌，但由于病人的放化療抵抗性極大限制了治療效果，嚴重影響鼻咽癌病人的5年生存率。近年來，發現分子靶向治療具有特異性強、副作用小等特點，成為臨床探究鼻咽癌治療的重點。近年來的研究證實，屬于膠原蛋白家族的Ⅰ型膠原α1 鏈（COL1A1）基因在乳腺癌、結腸癌等多種腫瘤組織中表達量顯著增加，下調COL1A1抑制細胞的增殖，促進細胞的凋亡，表明在腫瘤的病理演進過程中其發揮促進作用。但COL1A1在鼻咽癌中的作用尚不十分清楚，因此2017年9月至2018年12月，本研究通過小干擾RNA（Small interference RNA）下調鼻咽癌細胞中COL1A1的表達量，研究其對鼻咽癌細胞生物學特性的影響，為鼻咽癌的臨床治療提供分子靶位點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

鼻咽癌各細胞系（C666-1、CNE1、CNE2）以及人鼻咽上皮細胞（NP69）均購自北納生物，DMEM培養基、胎牛血清、Lipofectamine 2000、RNA試劑提取試劑盒購自美國Thermo公司，反轉錄試劑盒、實時定量PCR（qPCR）購自美國Sigma公司，噻唑藍（MTT）購自美國Bio Basic Inc公司；siRNA COL1A1以及陰性對照購自上海吉瑪公司，COL1A1抗體、鈣黏蛋白E（E-cadherin）抗體、波形蛋白（Vimentin）抗體、鈣黏蛋白N（N-cadherin）抗體購自美國Sigma公司。酶標儀、qPCR儀購自美國Thermo公司。

1.2 細胞的培養

鼻咽癌各細胞系（C666-1、CNE1、CNE2）培養于含10%胎牛血清DMEM培養基，5%二氧化碳、37 ℃培養箱孵育，每2～3 天加入胰酶消化、傳代。

1.3 細胞的轉染

選取生長良好的CNE1細胞，隨機分為對照組（常規培養）、si-NC組（轉染陰性對照）、si-COL1A1組（轉染siRNA COL1A1）。在Lipofectamine 2000說明書指示將轉染質粒和Lipofectamine 2000分別進行稀釋、混合，加入每孔細胞中培養4～6 h，更換培養基，置于5%二氧化碳、37 ℃培養箱中繼續培養。

1.4 qPCR實驗

采用RNA提取試劑盒提取各組細胞中總RNA，在反轉錄試劑盒說明書指示下合成cDNA。以鼠抗人三磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）為內參，進行qPCR實驗，反應條件為95 ℃5 min，95 ℃30 s，62 ℃30 s，72 ℃1 min，35個循環，72 ℃10 min，目的基因的表達量采用2法進行計算。其中，COL1A1引物（正向引物為5，-GTTGTGCGATGACGTGATCTGT-3， ，反向引物為5，-TTGGTCGGTGGGTGACTCTG-3，）以及GAPDH 引物（正向引物為5，-CTG GGCTAC ACTGAGCACC-3，，反向引物為5，-AAG TGG TCG TTG AGGGCA ATG-3，）由上海生工合成。實驗重復3次。

1.5 MTT 實驗

收集各組CNE1 細胞，將5×10個CNE1細胞接種至96孔板，分別培養24 h、48 h、72 h，每孔CNE1細胞中加入20 μL MTT，37 ℃孵育4 h，每孔CNE1細胞中加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），振蕩10 min，酶標儀檢測490 nm吸光值，記為A值。

1.6 Transwell實驗

在侵襲實驗前，Transwell上室膜中提前覆蓋Matrigel膠稀釋液，而遷移實驗無須此過程。收集各組CNE1細胞，將5×10個CNE1細胞加入Transwell上室，將600 μL含15%胎牛血清的培養基加入下室，培養24 h；PBS清洗、棄去殘留細胞，甲醛固定、結晶紫染色各30 min，顯微鏡取5個區域拍照、計數，取平均值。

1.7 蛋白質印跡法（Western blotting）

收集各組CNE1細胞，RIAP裂解液提取CNE1細胞總蛋白，10%SDS-PAGE 凝膠為介質，進行電泳，挑選目的條帶轉移至PVDF膜。置于5%封閉液孵育2 h，TBST清洗3次，加入COL1A1（1∶200）、E-cadherin一抗（1∶5 000）、Vimentin 一抗（1∶5 000）、N-cadherin 一抗（1∶2 000）、GAPDH一抗（1∶10 000），辣根過氧化物酶標記二抗（1∶1 000）孵育，加入ECL發光液，曝光、顯影、定影，檢測目的蛋白灰度值/GAPDH蛋白灰度值。

2 結果

2.1 COL1A1在細胞系中的表達量

與人鼻咽上皮細胞（NP69）相比，COL1A1 mRNA和蛋白表達量在鼻咽癌各細胞系（C666-1、CNE1、CNE2）中表達量增加（

P

＜0.05），其中在CNE1細胞中的表達量最高。結果如表1、圖1所示，

表1 各組細胞中COL1A1的表達量/±s

圖1 各組細胞中COL1A1蛋白的表達量

2.2 轉染siRNA COL1A1 對細胞中COL1A1 表達量的影響及敲低COL1A1 對CNE1 細胞增殖的影響

將siRNA COL1A1以及陰性對照轉染入CNE1細胞系中，從而敲低COL1A1的表達量，與對照組相比，COL1A1在si-NC組細胞中表達量變化差異無統計學意義，但在si-COL1A1 組細胞中表達量下降（

P

＜0.05）。與對照組相比，轉染陰性CNE1細胞增殖活性差異無統計學意義，但敲低COL1A1 的表達量降低CNE1細胞增殖活性（

P

＜0.05）。見表2、圖2。

圖2 轉染siRNA COL1A1對細胞中COL1A1蛋白表達量的影響

表2 轉染siRNA COL1A1對細胞中COL1A1表達量的影響及敲低COL1A1對CNE1細胞增殖的影響/±s

2.3 敲低COL1A1 對CNE1 細胞遷移、侵襲及上皮細胞間充質化（EMT）相關蛋白水平的影響

與對照組相比，轉染陰性對照的CNE1細胞侵襲、遷移細胞數無顯著變化，但敲低COL1A1的表達量降低CNE1細胞侵襲、遷移數目（

P

＜0.05）。與對照組相比，轉染陰性對照的CNE1 細胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin 蛋白表達量差異無統計學意義，但敲低COL1A1的表達量增加E-cadherin蛋白水平、降低Ncadherin、Vimentin 蛋白水平，差異有統計學意義（

P

＜0.05）。見表3，圖3。

表3 敲低COL1A1對CNE1細胞遷移、侵襲及EMT相關蛋白水平的影響/±s

圖3 敲低COL1A1對CNE1細胞的影響：A為EMT相關蛋白水平的影響；B為遷移和侵襲的影響

3 討論

腫瘤組織的形成過程是癌基因以及抑癌基因相互調控的過程。因此，探究腫瘤病理演進過程中的基因表達量變化對探究腫瘤發生發展機制具有重要的作用。COL1A1基因長約17 537 bp，位于人染色體17q21.33，包含51個外顯子，編碼Ⅰ型膠原纖維前體α 2 鏈，是細胞外基質的重要組成部分。研究發現，COL1A1在多種腫瘤組織中異常表達，參與腫瘤的發生發展。在乳腺癌中，COL1A1表達量異常，且與乳腺癌細胞增殖、遷移等過程有關，參與腫瘤的預后。在宮頸癌中，COL1A1 的表達量顯著增加，敲低COL1A1的表達量可通過調節細胞的凋亡率進而影響其放療敏感性，參與宮頸癌的放射治療過程。分析顯示，COL1A1在肝癌中表達量明顯異常，是肝癌病人預后的潛在靶基因。另外，研究發現，COL1A1在前列腺癌、喉癌等多種腫瘤病理進展過程中發揮重要的調控作用。

為探究COL1A1在鼻咽癌中的調控作用，本研究通過qPCR檢測發現，COL1A1在鼻咽癌細胞系C666-1、CNE1、CNE2中的表達量明顯增加，表明COL1A1參與鼻咽癌的病理進程，其中在CNE1細胞中的表達量較高，因此作為后續研究對象。在Lipofectamine 2000介導下將siRNA COL1A1轉染入CNE1細胞中，qPCR和Western blotting 檢測轉染效果，結果顯示，siRNA COL1A1顯著降低CNE1細胞中COL1A1 mRNA和蛋白的表達量，表明siRNA COL1A1 質粒可穩定下調COL1A1 的表達量。MTT 和Transwell 法檢測敲低COL1A1 對細胞增殖、侵襲、遷移的影響，結果顯示，COL1A1表達量降低抑制CNE1細胞增殖，降低其侵襲、遷移能力，表明COL1A1可通過調節鼻咽癌細胞的生物學特性，進而調控其腫瘤組織的生長。

腫瘤細胞的侵襲、遷移特性受多種基因、信號通路的調控，與腫瘤病人的預后緊密相關。研究表明，腫瘤組織發生轉移的過程不僅與基因水平相關，還與上皮細胞轉變形成間質細胞有關。在生理或病理狀態下，EMT 的形成過程主要與上皮性標志物（Ecadherin）、間質性標志物（Vimentin、N-cadherin）的水平顯著相關，在腫瘤發生發展、細胞遷移過程中發揮重要作用。為探究COL1A1調控CNE1細胞增殖、侵襲、遷移的作用機制，本實驗通過Western blotting檢測細胞中EMT相關蛋白的表達量，結果發現，敲低COL1A1的表達量促進E-cadherin蛋白表達，抑制Vimentin、N-cadherin蛋白表達，表明敲低COL1A1可通過抑制EMT過程，從而影響細胞的增殖、侵襲、遷移。

綜上所述，COL1A1在鼻咽癌細胞中的表達量增加；敲低COL1A1表達量抑制鼻咽癌CNE1細胞增殖、侵襲、遷移，可能通過影響EMT過程。本實驗只在鼻咽癌CNE1細胞中探究了COL1A1的作用以及可能分子機制，未來會在鼻咽癌多株細胞系以及動物、臨床樣本中進一步探究COL1A1參與鼻咽癌發生發展的具體作用以及與相關信號通路的調控作用。