芍藥苷通過調控硫氧還蛋白結合蛋白表達對脂多糖誘導的腎小球系膜細胞氧化應激及凋亡的影響

劉俊英，郭志玲

作者單位：河南科技大學第一附屬醫院腎內科，河南 洛陽471003

免疫球蛋白A（IgA）腎病屬于原發性腎小球腎炎，而腎小球系膜細胞異常增生及系膜基質增多是腎小球腎炎的主要病因。腎小球系膜細胞增殖與脂多糖（Lipopolysacharide，LPS）、炎性細胞因子等密切相關，其可促使多肽因子等致纖維化因子釋放而促進細胞外基質合成進而引發腎小球腎炎。既往研究顯示腎小球系膜細胞過度凋亡也可促進腎炎的發生。因而抑制腎小球系膜細胞凋亡對腎小球腎炎的治療具有重要意義。研究表明芍藥苷可減少活性氧（ROS）的含量從而減輕氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）誘導的內皮細胞損傷。芍藥苷可通過抗氧化作用減輕LPS 誘導的小鼠急性炎癥腦損傷。但芍藥苷對LPS 誘導的腎小球系膜細胞氧化應激及凋亡的影響尚未可知。研究表明硫氧還蛋白結合蛋白（thioredoxin interacting protein，TXNIP）在高糖誘導的小鼠腎小球系膜細胞中上調表達，TXNIP 表達下調可減少ROS 的產生而增強抗氧化能力。本研究從2018年1月至2019年7月期間采用LPS 誘導的腎小球系膜細胞，探討芍藥苷對腎小球系膜細胞氧化應激及凋亡的影響，分析其對TXNIP的調控作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

芍藥苷購自陜西百草萃生物；LPS 購自美國Sigma；人腎小球系膜細胞HMCL 購自湖南豐暉生物。丙二醛（MDA）檢測試劑盒購自武漢艾美捷；超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒購自日本同仁化學公司；谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）檢測試劑盒購自上海酶聯生物；細胞凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶；兔抗人B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）、B 淋巴細胞瘤-2 相關蛋白（Bax）、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved-Caspase3）抗體購自美國Abcam 公司；二抗購自美國Thermo Fisher Scientific；兔抗人TXNIP 多克隆抗體購自上海生工生物；TXNIP 小干擾RNA（si-TXNIP）、亂序無意義陰性序列（si-NC）購自廣州銳博生物科技有限公司；pcDNA3.1 購自上海索寶生物科技有限公司；Lipofectamine2000 購自美國Invitrogen 公司；Trziol、反轉錄與熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1

藥物處理及實驗分組 HMCL 細胞隨機分為對照組（Con 組）、LPS 組、LPS+芍藥苷-低組、LPS+芍藥苷-中組、LPS+芍藥苷-高組，其中Con 組細胞未經LPS與芍藥苷處理，其余各組均使用濃度為10 nmol/L的LPS誘導細胞，芍藥苷不同劑量組分別加入終濃度為5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L的芍藥苷處理細胞24 h。觀察芍藥苷對細胞凋亡及氧化應激指標的影響，篩選適宜濃度進行后續實驗。后續研究為驗證芍藥苷與TXNIP的調控作用，將HMCL細胞隨機分為LPS+si-NC 組（細胞中轉染si-NC 24 h，用含有10 nmol/L的LPS處理細胞24 h）、LPS+si-TXNIP組（細胞中轉染si-TXNIP 24 h，用含有10 nmol/L 的LPS 處理細胞24 h）、LPS+芍藥苷+pcDNA組（細胞中轉染pcDNA 24 h，用含有10 nmol/L的LPS與20 μmol/L的芍藥苷共同處理24 h）、LPS+芍藥苷+pcDNA-TXNIP組（細胞中轉染pcDNA-TXNIP 24 h，用含有10 nmol/L 的LPS與20 μmol/L的芍藥苷共同處理24 h）。

1.2.2

檢測MDA、SOD、GSH-Px水平 各組細胞處理結束后，采用硫代巴比妥酸法測定MDA含量，采用水溶性四唑鹽法檢測SOD活性，二硫代二硝基甲苯酸法檢測GSH-px活性，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.3

流式細胞術檢測細胞凋亡 收集各組對數生長期HMCL 細胞，按照凋亡檢測試劑盒說明書檢測細胞凋亡率。

1.2.4

qRT-PCR 檢測細胞中TXNIP mRNA 表達水平 收集各組HMCL細胞，采用Trizol法提取細胞總RNA，參照反轉錄試劑盒合成cDNA，按照熒光定量試劑盒且以cDNA 為模板配置qRT-PCR 反應體系，qRT-PCR 反應條件：94 ℃2 min（循環1 次），94 ℃20 s，58 ℃20 s，72 ℃20 s（循環40 次）。用美國ABI StepOnePlus 實時熒光定量PCR 儀計算TXNIP mRNA相對表達量。

1.2.5

Western blotting 檢 測TXNIP、Bcl-2、Bax、cleaved-caspase3 蛋白表達 提取各組對數生長期HMCL細胞總蛋白，取30 μg蛋白進行SDS-PAGE，轉膜，用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入一抗稀釋液（1∶500），4 ℃孵育24 h，加入二抗稀釋液（1∶1 000），室溫孵育1 h，ImageJ軟件對蛋白進行半定量分析。

2 結果

2.1 芍藥苷對脂多糖誘導的腎小球系膜細胞氧化應激的影響

與Con 組相比，LPS 組腎小球系膜細胞中MDA 含量升高（

P＜

0.05），SOD、GSH-Px 活性降低（

P＜

0.05）；與LPS組相比，LPS+芍藥苷-低組、LPS+芍藥苷-中組、LPS+芍藥苷-高組腎小球系膜細胞中MDA 含量降低（

P＜

0.05），SOD、GSH-Px 活性升高（

P＜

0.05），見表1。

表1 芍藥苷對脂多糖誘導的腎小球系膜細胞氧化應激的影響（重復次數=3，n=9）/±s

2.2 芍藥苷對脂多糖誘導的腎小球系膜細胞凋亡的影響

與Con 組比較，LPS 組腎小球系膜細胞凋亡率增加（

P＜

0.05），相較于LPS 組，LPS+芍藥苷-低組、LPS+芍藥苷-中組、LPS+芍藥苷-高組腎小球系膜細胞凋亡率降低（

P＜

0.05），見圖1、圖2、表2。

圖1 芍藥苷對脂多糖誘導的腎小球系膜細胞凋亡相關蛋白表達

表2 芍藥苷對脂多糖誘導的腎小球系膜細胞凋亡的影響（重復次數=3，n=9）/±s

2.3 芍藥苷對脂多糖誘導的腎小球系膜細胞中TXNIP表達的影響

與Con組相比，LPS組腎小球系膜細胞中TXNIP mRNA及蛋白表達量升高（

P＜

0.05）；相較于LPS組，LPS+芍藥苷-低組、LPS+芍藥苷-中組、LPS+芍藥苷-高組腎小球系膜細胞中TXNIP mRNA及蛋白表達量降低（

P＜

0.05），見圖3、表3。

圖3 TXNIP蛋白表達

表3 芍藥苷對脂多糖誘導的腎小球系膜細胞中TXNIP表達的影響（重復次數=3，n=9）/±s

2.4 干擾TXNIP 表達對脂多糖誘導的腎小球系膜細胞氧化應激和凋亡的影響

與LPS+si-NC 組相比，LPS+si-TXNIP 組腎小球系膜細胞中TXNIP 的表達量降低，MDA 含量減低，SOD、GSH-Px 活性升高，細胞凋亡率降低，Bcl-2蛋白表達量升高，Bax蛋白表達量降低（均

P＜

0.05），見圖4、表4。

圖4 干擾TXNIP表達對凋亡相關蛋白的影響

表4 干擾TXNIP表達對脂多糖誘導的腎小球系膜細胞氧化應激和凋亡的影響（重復次數=3，n=9）/±s

2.5 TXNIP 過表達逆轉了芍藥苷（20

μ

mol/L）對脂多糖誘導的腎小球系膜細胞氧化應激和凋亡的作用

與LPS+芍藥苷+pcDNA 組相比，LPS+芍藥苷+pcDNA-TXNIP 組腎小球系膜細胞中TXNIP 蛋白表達量升高（

P＜

0.05），MDA 含量升高（

P＜

0.05），SOD、GSH-Px 活性降低（

P＜

0.05），細胞凋亡率升高（

P

＜0.05），Bcl-2 蛋白表達量降低（

P＜

0.05），Bax 蛋白表達量升高（

P＜

0.05），見圖5、表5。

圖5 TXNIP過表達和凋亡相關蛋白表達

表5 TXNIP過表達逆轉了芍藥苷對脂多糖誘導的腎小球系膜細胞氧化應激和凋亡的作用（重復次數=3，n=9）/±s

3 討論

腎小球腎炎可引起慢性腎功能衰竭，若腎小球炎癥、氧化應激及損傷等過程中腎小球系膜細胞過度增殖可增加炎性細胞因子的釋放量最終引發腎小球硬化。研究表明LPS具有趨化細胞的作用并可誘導腎小球系膜細胞增殖。因此本研究主要采用LPS處理腎小球系膜細胞，探討芍藥苷對腎小球系膜細胞氧化應激及凋亡的影響及其作用機制。

芍藥苷可通過降低ROS水平而改善LPS誘導的H9C2 細胞氧化應激損傷。研究表明芍藥苷可能通過下調ABCA1 表達而抑制LPS 誘導的THP-1 細胞炎癥因子分泌及釋放。相關報道指出芍藥苷可抑制小膠質細胞的炎癥反應。本研究結果顯示LPS 誘導的腎小球系膜細胞HMCL 中MDA 含量升高，而SOD、GSH-Px 活性降低，提示LPS 誘導的HMCL 細胞氧化應激損傷模型構建成功。研究表明氧化應激可誘導細胞凋亡，MDA 生成量增加可加重氧化應激損傷，SOD、GSH-Px 屬于抗氧化酶類，提高SOD、GSH-Px 活性可抑制氧化應激反應。本研究結果顯示不同濃度的芍藥苷均可降低LPS誘導的HMCL 細胞氧化應激產物MDA 生成，增加內源性抗氧化酶SOD、GSH-Px 活性而抑制LPS 誘導的氧化應激損傷從而發揮保護作用。研究報道指出細胞凋亡在腎病發生發展過程中發揮重要作用，高糖可誘導腎小球系膜細胞中Bax、cleaved-caspase3 的表達及抑制Bcl-2 的表達而促進細胞凋亡從而加重疾病嚴重程度。與上述研究報道相似，本研究結果顯示LPS誘導的HMCL細胞中Bax、cleaved-caspase3蛋白表達量升高，Bcl-2 蛋白表達量降低，細胞凋亡率升高，說明LPS 可誘導腎小球系膜細胞凋亡。進一步研究結果顯示，不同濃度的芍藥苷處理后可抑制細胞凋亡及Bax、cleaved-caspase3 蛋白表達，而促進Bcl-2蛋白表達，提示芍藥苷可通過調控細胞凋亡相關蛋白表達而抑制腎小球系膜細胞凋亡。

TXNIP可通過與硫氧還蛋白結合而抑制其抗氧化作用，并可促進ROS 生成引發氧化應激反應從而誘導細胞凋亡，研究表明TXNIP 介導的氧化應激在糖尿病腎病、動脈粥樣硬化等多種疾病發生發展過程中發揮重要調控作用。研究表明人腎小管上皮細胞高糖缺氧復氧損傷中TXNIP 表達升高，抑制TXNIP的表達可減緩高糖缺氧復氧損傷。相關報道指出抑制TXNIP/NLRP3 信號通路可通過減輕氧化應激損傷而減輕腎臟損傷。與上述報道結果顯示，本研究結果顯示LPS 誘導的HMCL 細胞中TXNIP 的表達水平升高，不同濃度的芍藥苷可降低TXNIP的表達，且隨著芍藥苷濃度的增加而降低，提示芍藥苷可抑制LPS誘導的HMCL 細胞中TXNIP 的表達。本研究發現干擾TXNIP 的表達可降低HMCL細胞凋亡率，提高SOD、GSH-Px活性，降低MDA含量，并可促進Bcl-2的表達，而抑制Bax的表達，提示干擾TXNIP 的表達可通過減輕氧化應激損傷從而對LPS誘導的腎小球系膜細胞發揮抗凋亡作用。本研究進一步分析顯示TXNIP過表達可逆轉芍藥苷對LPS誘導的腎小球系膜細胞氧化應激與凋亡的作用，提示芍藥苷可通過抑制TXNIP的表達而拮抗氧化應激對腎小球系膜細胞的損傷從而發揮保護腎臟作用。

綜上所述，芍藥苷可通過抑制TXNIP 的表達減輕LPS誘導的細胞氧化應激損傷，抑制細胞凋亡，可能作為保護腎小球系膜細胞的新型藥物，有望為腎小球硬化、腎小球腎炎等腎臟疾病的臨床治療提供新方向。