蘋果樹腐爛病菌小G蛋白VmRab7基因的功能分析

張小龍，吳 淇，田潤澤，徐亮勝，黃麗麗

(西北農林科技大學 植物保護學院，旱區作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西 楊陵 712100)

蘋果在我國種植面積廣泛，帶來了很高的經濟效益。據統計，2018年我國蘋果產量高達3 920萬t。在生產總量如此高的情況下，我國蘋果單位面積產量卻遠低于世界平均水平[1]。果樹病害是不容忽視的主要原因之一。蘋果樹腐爛病是蘋果生產中的一種破壞性病害，病原真菌(Valsamali)侵入枝干引起病斑，危害果實品質和產量，嚴重導致果樹死亡[2]，生物源殺菌劑是有效的防治辦法[3]。研究表明，蘋果樹腐爛病菌的主要致病因子包括毒素、效應蛋白、細胞壁降解酶等[4-8]，但仍有許多致病因素并未揭示。全面探究蘋果樹腐爛病菌的不同致病因子，有利于蘋果生產中的病害預防和控制。

小G蛋白是只有單個結構域的G蛋白(GTP-binding proteins)，其分子量約在20～30 ku，作為分子開關調節多個細胞生理過程，包括信號傳導、囊泡轉運、細胞的形狀、運動性和極性等[9]。小G蛋白根據功能可分為8個亞家族：Arf、Ran、Rab、Rho、Ras、Sar1、線粒體Rho和線粒體Roc蛋白[10]。Rab蛋白作為小G蛋白成員調控著囊泡轉運過程。囊泡出芽包裹貨物分子，通過擴散或通過馬達蛋白介導的方式沿著細胞骨架轉運至靶細胞器，與其質膜相互識別，并錨定到受體膜上，最終完成膜融合過程[11]。Rab蛋白和系連因子一起決定了囊泡的靶向特異性。Rab蛋白被特定的鳥苷酸交換因子(GEF)激活，由與GDP結合的失活構象轉變為與GTP結合的激活構象，只有激活構象才能與下游的效應因子相互作用。隨后，激活態Rab蛋白在GAPs作用下水解GTP，釋放1個Pi基團而失活。然后與GDP解離抑制因子(GDI)結合，維持失活態，游離于細胞質中，以循環利用[12]。激活構象的Rab7蛋白招募HOPS復合物，通過結合其2個亞基Vps39和Vps41，參與酵母液泡的同型融合以及囊泡與液泡融合過程。HOPS復合體能夠識別每個SNARE，并組裝三元反式復合物，以便與第4個Qa-SNARE快速融合，驅動膜融合過程[13]。最初提出其亞基Vps39是Rab7的鳥苷酸交換因子(GEF)[14]。后來得到更正，Mon1-Ccz1復合物對Rab7具有GEF活性[15]。Rab5、Mon1-Ccz1、Rab7形成的分子級聯機制，使得以Rab5為標志的早期內涵體，以GEF Mon1-Ccz1復合物為媒介，成熟到以Rab7為標志的晚期內涵體，保證了囊泡轉運及降解過程的正常周轉。細胞自噬是一類降解途徑，通過自噬體包裹受損細胞器和錯誤蛋白質等，轉運至液泡或溶酶體中進行降解，釋放氨基酸等組分用于應激條件下胞內正常穩態的維持[16]。細胞自噬過程與囊泡轉運具有相似性，并且共用許多組分。Rab5和Rab7還控制著不同的自噬步驟，Rab5參與自噬體的閉合過程，Rab7作用于自噬體與液泡的融合過程[17]。在稻瘟病菌中，MoRab7主要定位于液泡膜，其缺失突變體表現出菌絲體生長速率和分生孢子量降低，分生孢子畸形并且附著胞發育缺陷[18]。FgRab7與FgAtg9互作來調控FgAtg9的動態運輸，這對于細胞自噬過程和禾谷鐮刀菌的致病性至關重要[19]。

本研究從蘋果樹腐爛病菌的全基因組中鑒定到一個與釀酒酵母(S.cerevisiae)ScYpt7同源的基因VmRAB7。VmRab7基因的功能在蘋果樹腐爛病菌中尚不清楚。為明確VmRab7在蘋果樹腐爛病菌的菌絲生長發育和致病過程中的作用，利用同源重組的方法進行基因敲除，觀察敲除突變體的菌落形態、產孢情況及致病力的變化；為明確VmRab7在液泡融合和細胞自噬中的作用，利用透射電鏡觀察敲除突變體的液泡形態和自噬體的形成。研究結果為解析小G蛋白在蘋果樹腐爛病菌的致病過程及生長發育中的功能打下基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和試劑

1.1.1 試驗材料V.mali強毒力菌株03-8，由西北農林科技大學果樹病害病原生物學及綜合防治科研團隊鑒定保存。1年生枝條和葉片(蘋果富士品種)采摘自陜西省楊凌區蘋果園。PFL2和PDL2質粒載體由西北農林科技大學許金榮教授惠贈。

1.1.2 主要試劑 DNA片段回收試劑盒(OMEGA)；真菌基因組DNA提取試劑盒(BioFlux)；高保真酶、一步克隆酶(南京諾唯贊)；裂解酶、崩潰酶(Sigma)；氨芐青霉素、卡那霉素、遺傳霉素、潮霉素(上海生工)；試驗所用引物由上海生工合成(表1)。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因敲除與回補 利用同源重組方法，將VmRAB7基因置換為G418抗性基因。設計引物1F/2R和3F/4R，用于擴增VmRAB7基因ORF的上游區域和下游區域約1.2 kb片段。引物G418-F/R從PFL2質粒上擴增G418抗性基因。利用Double-Joint的方法將上述3個片段融合[20]，并用CF/CR大量擴增，濃縮PCR產物，得到VmRAB7基因敲除盒。在PEG/CaCl2作用下將10 μg的敲除盒轉入03-8原生質體[21]，遺傳霉素篩選，得到的轉化子利用4對引物進行PCR檢測。利用回補引物C-F/R擴增靶標基因及包含起始密碼子前約1.5 kb片段，克隆至PDL2載體，測序正確得到回補載體。將敲除突變體菌株制備成原生質體，將回補載體導入突變體的原生質體中，潮霉素篩選轉化子。提取DNA，5F/6R檢測靶標基因的回補。

表1 試驗所用引物Table 1 Primers in the study

1.2.2 生長速率測定 將03-8菌株、ΔVmrab7及回補菌株在PDA平板上活化培養2 d，用直徑5 mm打孔器從菌落邊緣即活性最高區域處獲得菌絲塊，轉接到厚度均為12.5 mm的PDA平板，25℃培養2 d后，分別測量菌落橫向和縱向直徑，計算菌絲培養兩天的生長速率。

1.2.3 致病力測定 取當天采摘蘋果富士品種的1年生枝條及葉片為試驗材料，將枝條處理成粗細均勻的小段，反復沖洗，浸泡在0.6%次氯酸鈉溶液中消毒，滅菌蒸餾水洗去殘留，枝條兩端用蠟封口。葉片采用同種方法消毒，葉柄處包裹浸潤的無菌棉球。相同條件下活化03-8菌株、ΔVmrab7及回補菌株，從菌落邊緣打孔獲得菌餅，接種到處理好的枝條和葉片上，菌絲面緊貼植物組織面。噴灑無菌蒸餾水并用保鮮膜覆蓋，25℃恒溫培養3 d后，測量病斑的直徑，每個處理3次重復。

1.2.4 透射電鏡樣品制備 活化03-8菌株和ΔVmrab7菌株，在無菌操作臺中用接種針輕輕刮取菌落邊緣菌絲，轉接入液體YEPD中25℃培養18～24 h，待菌絲球呈綠豆大小時，轉移到含有2 mmol·L-1PMSF的MM-N液體培養基中，氮饑餓8 h誘導自噬發生。8 h后過濾除去培養基，無菌ddH2O沖洗若干次，每個菌株挑取3個菌絲球，輕輕在牛血清中蘸取，晾干。制樣切片，透射電鏡觀察。

2 結果與分析

2.1 VmRAB7的基因敲除與回補

將釀酒酵母的ScYpt7氨基酸序列在蘋果樹腐爛病全基因組數據庫中進行同源比對，鑒定到1個同源蛋白，蛋白一致性約66%，命名為VmRab7(VM1G_11105)。為明確其基因功能，對VmRAB7進行基因敲除。轉化子利用四對引物進行PCR檢測。5F/6R不能擴增靶標基因條帶，其余3對引物G850/G852、7F/G855R和G856F/8R能擴增出正確條帶，證明VmRAB7基因敲除成功。并利用引物5F/6R檢測VmRAB7的回補(圖1)。

注：A.VmRAB7基因敲除示意圖；B.基因敲除的PCR檢測，M.DNA marker，1.靶標基因，2.G418抗性基因，3.上游區域，4.下游區域；C.回補菌株的PCR檢測，M.DNA marker，1～3.3個回復菌株。

2.2 VmRab7調控蘋果樹腐爛病菌的營養生長和產孢過程

為了明確VmRab7在蘋果樹腐爛病菌絲的生長發育中的作用，對突變體進行生長速率的測定。結果顯示，ΔVmrab7菌株相比野生型而言，菌絲生長速率顯著降低。VmRAB7的敲除使菌絲生長速率降低了約40%。培養30 d后，野生型菌株和回補菌株已產生分生孢子，而ΔVmrab7菌株呈紅褐色，并喪失了產孢能力(圖2)。表明VmRab7參與了蘋果樹腐爛病菌的營養生長和產孢過程。

注：A.培養2 d和30 d后的菌落形態；B.生長速率測定；C.產孢量測定；WT：野生型菌株，ΔVmrab7：敲除突變體菌株，ΔVmrab7-C：回補菌株；***：P<0.001。

2.3 VmRab7影響蘋果樹腐爛病菌的致病力

為了明確VmRab7對蘋果樹腐爛病菌絲的致病力的影響，進行離體葉片枝條接種測量病斑長度。結果顯示，與野生型相比，Vmrab7敲除突變體的致病力顯著降低。VmRAB7基因的敲除使菌絲致病力在枝條上降低了約50%，在葉片上降低了約53%(圖3)。表明VmRab7影響蘋果樹腐爛病菌的致病力。

注：A.葉片接種的發病情況；B.枝條接種的發病情況；C.病斑長度的測定。***：P<0.001。

2.4 VmRab7影響液泡形態和細胞自噬

為了明確VmRab7在蘋果樹腐爛病菌的液泡融合和細胞自噬中的功能，將WT菌株、突變體ΔVmrab7接種在含有2 mM PMSF的MM-N液體培養基中，氮饑餓誘導自噬發生。樣品處理后在透射電鏡下觀察。在液泡形態方面，WT菌株含有圓而飽滿的大液泡，而ΔVmrab7菌株具有小且多的碎片化液泡；誘導自噬發生后，WT菌株的液泡中存在若干個球狀的自噬體，而ΔVmrab7的液泡中未能觀察到這種結構(圖4)。結果表明，VmRab7參與蘋果樹腐爛病菌的液泡形態建成和細胞自噬過程。

注：V指代大液泡；箭頭指向自噬體。

3 結論與討論

本研究對蘋果樹腐爛病菌中的小G蛋白VmRab7進行了功能研究，結果表明VmRab7調控著蘋果樹腐爛病菌的營養生長、產孢、致病力、液泡形態和細胞自噬過程。相比野生型，ΔVmrab7敲除突變體在PDA培養基上的生長速率降低了約40%。培養30 d后，突變體菌株呈現紅褐色，并喪失了產孢能力。表明VmRab7影響蘋果樹腐爛病菌的營養生長和產孢。VmRAB7基因的敲除使菌絲致病力在枝條上降低了約50%，在葉片上降低了約53%。表明VmRab7影響蘋果樹腐爛病菌的致病力。

細胞自噬的標志是自噬體結構的產生，是判斷自噬發生或受阻的明顯特征。在透射電鏡下，ΔVmrab7菌株的液泡中未能觀察到球狀的自噬體結構，表明VmRAB7的缺失中斷了細胞自噬過程。此外，ΔVmrab7菌株不存在飽滿的大液泡，其液泡呈現碎片化的形態。表明VmRab7作用于液泡的同型融合。自噬體與液泡的融合也屬于生物膜的融合過程，與液泡的同型融合相似，它們之間共用許多組分，包括Rab7及其GEF Mon1-Ccz1、HOPS復合物、SNARE蛋白(Vam3、Vam7、Vti1和Ykt6)。這些基因的缺失都表現出在液泡形態和細胞自噬方面的雙重缺陷[22]。

Mon1-Ccz1復合體是Rab7的鳥苷酸交換因子(GEF)[15]。在秀麗隱桿線蟲(C.elegans)中，Mon1和Ccz1的共表達才與Rab7相互作用，單個Mon1或Ccz1都不能與Rab7互作[23]。但在禾谷鐮刀菌(F.graminearum)中，沒有FgCcz1的協助，單個FgMon1與激活態和失活態FgRab7均存在相互作用[24]。VmRab7是被Mon1激活還是被Mon1-Ccz1復合體激活是需要驗證的問題。最近有研究發現，Rab7的鳥苷酸交換因子Ccz1蛋白的C末端存在2個LIR基序，Mon1-Ccz1復合體通過這2個基序與Atg8直接結合，從而促進Rab7的激活來調控自噬體與液泡的融合[25]。但目前植物病原真菌中的Ccz1蛋白還未見報道，鑒定蘋果樹腐爛病菌中的相關基因，將為全面解析Rab5、Mon1-Ccz1、Rab7分子級聯機制在囊泡轉運及細胞自噬兩種途徑中的作用提供基礎。自噬過程調控稻瘟病菌的附著胞發育和膨壓形成。自噬缺陷的病菌形成的侵染結構不能穿透植物表皮，造成了真菌致病力的減弱，這種機制是自噬影響該真菌致病性的主要原因之一[26]。細胞自噬影響蘋果樹腐爛病菌致病性的分子機理及其獨特性是需要進一步研究的內容。