石灰和雙氰胺對紅壤酸化和硝化作用的影響及其機制*

張昊青，趙學強?，張玲玉，沈仁芳

（1. 土壤與農業可持續發展國家重點實驗室（中國科學院南京土壤研究所），南京 210008；2. 中國科學院大學，北京 100049）

中國南方酸性紅壤區面積218 萬km2，約占全國土地總面積的22.7%[1]。該地區水熱資源豐富，有著巨大的農業生產潛力[2]。然而，由于土壤鋁毒、錳毒、酸害及養分缺乏等一系列植物生長限制因子，酸性土壤的巨大生產潛力難以發揮[2-3]。近年來，由于氮肥的大量施用，我國農田土壤酸化嚴重，不僅限制了農業生產力，也威脅到生態環境質量[4-5]。與全國其他地區相比，紅壤區的酸化問題更為突出[6]。實現酸性紅壤的可持續利用，是關系到國家糧食安全和環境保護的重要課題。

施用酸性土壤改良劑是提高酸性土壤作物生產力的一個主要策略[2，5]，其中石灰是最傳統且效果顯著的酸性土壤改良劑。施用石灰可快速提高土壤pH，顯著改善酸性土壤上植物的生長，但在土壤pH提高的同時，又會不可避免地加速土壤硝化作用[7]。硝化作用的加速，一方面引起質子積累，加重土壤酸化程度；另一方面，增加土壤中硝態氮的累積，在高溫多雨的南方紅壤區，硝態氮極易發生徑流、淋洗和反硝化損失，從而對水體質量和空氣質量構成潛在威脅[8]。由于土壤顆粒表面一般帶負電荷，與帶負電的硝酸根相比，帶正電的銨離子更易被土壤吸附和晶格固定，不易隨水淋失[9]。此外，與吸收硝態氮相比，植物根系吸收銨態氮不需要還原過程，一般耗能較少，速率較快，容易獲得較高生物量[10]。酸性土壤硝化作用較弱，銨態氮/硝態氮的比例較高，由于長期進化適應的原因，酸性土壤上生長的植物一般較為偏好銨態氮且耐鋁毒[11]。利用銨態氮和鋁的協同作用是提高酸性土壤氮效率的主要策略之一[12]。因此，若能有效抑制石灰誘導的酸性紅壤硝化作用，將土壤中的銨硝比維持在較高水平，不僅可以降低硝態氮淋失及反硝化造成的環境風險，提高氮肥利用效率，同時也能減緩硝化作用引起的土壤酸化，維持酸性紅壤區農業的可持續發展。

硝化抑制劑種類較多， 其中， 雙氰胺（Dicyandiamide，DCD）是目前廣泛應用于農業生產中的一種硝化抑制劑。利用DCD 延緩銨態氮向硝態氮的轉化，可有效降低土壤氮素損失，提高作物產量和改善品質，提高氮肥利用率[13]。DCD 在農業上的應用效果已有大量報道，其施用效果經常依賴于土壤環境和管理措施，在不同條件下存在很大差異[13-15]。在酸性土壤地區，為了改善作物生長，經常施用石灰以提高土壤pH。一方面，土壤pH 是調控土壤中的硝化過程和硝化微生物的關鍵因素[16]，施用石灰導致的土壤pH 增加會加速酸性土壤中的硝化過程，進而可能會影響DCD 的作用效果。另一方面，DCD 通過抑制土壤硝化作用，減緩土壤酸化，也可能改變石灰的作用效果。目前研究多集中于石灰或DCD 單一因素對土壤硝化作用的影響，對于石灰和DCD 配合施用對酸性土壤硝化過程的影響及其機制的研究尚鮮有報道。基于上述考慮，為了探究石灰和DCD 配合施用對酸性土壤pH 和硝化作用的影響及其機制，本文比較分析了石灰和DCD 交互作用對酸性土壤培養過程中pH、銨態氮和硝態氮含量及硝化微生物（氨氧化細菌和氨氧化古菌）豐度的影響。研究結果旨在為酸性土壤改良和氮素優化管理提供理論基礎和科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試紅壤發育于第四紀紅黏土，采集自江西省鷹潭市中國科學院紅壤生態試驗站旱地農田，該地區屬于亞熱帶濕潤季風氣候，年平均降水量 1882 mm。采集0～20 cm 的新鮮土壤樣品，剔除雜物及殘留根系后，風干，磨細，分別過1 mm 和0.149 mm 孔徑篩備用。

于試驗開始前進行供試土壤的基本理化性質分析。用pH 計（PB-21，Sartorius，德國）在土水比為1∶2.5 的條件下測得土壤pH 為4.80；用2 mol·L-1KCl 浸提，流動分析儀（San++ System，SAKLAR，荷蘭）測得土壤初始硝態氮含量為1.42 mg·kg-1，銨態氮含量為3.10 mg·kg-1；用鹽酸-氟化銨浸提，鉬銻抗比色法測得土壤有效磷含量為3.00 mg·kg-1；用1 mol·L-1乙酸銨浸提，火焰光度法測得土壤速效鉀含量為67.90 mg·kg-1；用低溫外加熱重鉻酸鉀氧化—比色法測得土壤有機質含量為8.9 g·kg-1。

1.2 試驗設計

試驗包括兩個因素，A 因素為石灰（CaCO3）用量，分別為0、2、4、6 g·kg-1干土；B 因素為DCD，分為不施用DCD（-DCD）和施用DCD（+DCD）。共8 個處理，每個處理重復3 次。同時，所有處理均供應200 mg·kg-1（以N 計）尿素作為氮源。DCD用量為20 mg·kg-1干土（施氮量的10%）。DCD 由上海麥克林生化科技有限公司生產，含量980 g·kg-1。

首先，稱取50 g 過1 mm 篩的風干土于培養瓶中，分別加入不同量的石灰，與土壤充分混勻，得到不同石灰添加量的土壤。再將同一石灰用量的土壤分為兩份，一份僅加入尿素溶液，另一份加入尿素和DCD 的混合溶液。另加入一定量去離子水以維持正常的水分含量和通氣狀態。用塑料膜將培養瓶封口，并在中間留出小孔以創造好氣環境。將培養瓶置于25 ℃人工氣候室中恒溫黑暗培養。培養期間每3 天采用稱重法補水1 次，使土壤水分保持基本恒定。于培養開始后的0、7、14、21 和35 d 分別取樣，取樣后立即用2 mol·L-1KCl 溶液浸提，浸提液置于4 ℃冰箱保存，用于測定土壤銨態氮和硝態氮含量。同時，于培養開始后第35 天采集土壤樣品，置于-20 ℃冰箱，用于土壤DNA 的提取。

1.3 土壤微生物總DNA 的提取

于培養結束時（第35 天），采用FastDNA Spin Kit For Soil 試劑盒（北京天根生化科技有限公司），提取土壤總DNA。稱取0.50 g 土壤樣品，按照試劑盒說明書進行提取。用微量分光光度計（NanoDrop ND-1000 spectrophotometer，美國）檢測提取DNA樣品的濃度和純度，后保存至-20 ℃冰箱，以用于氨氧化微生物amoA基因拷貝數檢測。

1.4 氨氧化細菌和氨氧化古菌中amoA 基因實時熒光定量PCR 分析

氨氧化古菌（Ammonia-oxidizing archaea；AOA）和氨氧化細菌（Ammonia-oxidizing bacteria；AOB）中amoA基因豐度采用PCR 擴增儀（LightCycler 480real-time PCR system，Roche，德國）進行定量分析。所采用的引物序列及反應程序如表1 所示。試驗采用引物由南京金斯瑞生物科技有限公司生產，SYBR Premix Ex Taq 由日本TaKaRa 公司生產。實時熒光定量PCR 分析以提取的土壤DNA 為模板，反應體系為10 μL，包括1 μL DNA 模板、5 μL SYBR Premix Ex Taq，前后引物各1 μL 及2 μL 滅菌雙蒸水。同時設置空白對照，即以滅菌雙蒸水代替土壤DNA 作為反應模板。每個樣品3 次技術重復。

表1 氨氧化古菌（AOA）與氨氧化細菌（AOB）amoA 基因定量PCR 引物序列及反應程序Table 1 Primer sequences and reaction procedures of ammonia-oxidizing archaea（AOA）and ammonia-oxidizing bacteria（AOB）amoA gene quantitative PCR

標準曲線的制作：通過溶菌肉湯（LB，Lysogeny Broth）培養基培養含有目的基因的克隆子，按照試劑盒（FavorPrep Plasmid Extraction Mini Kit，FAVORGEN Bio，中國）的操作步驟進行質粒的提取和純化。提取后的質粒用微量分光光度計（NanoDrop ND-1000 spectrophotometer，美國）檢測其濃度，并以10 倍梯度對質粒進行稀釋，得到標準曲線。標準曲線重復3 次，擴增效率均在92%～105%之間，決定系數R2均大于0.99。

1.5 數據處理

土壤表觀硝化率是土壤中硝態氮含量占土壤銨態氮含量和硝態氮含量之和的百分數[19]。

數據采用SPSS19.0 進行統計分析。采用單因素方差分析檢驗不同石灰用量處理間土壤硝態氮、銨態氮、表觀硝化率、土壤pH 及AOA 和AOB 中amoA基因豐度的差異顯著性。采用獨立樣本t-檢驗分析同一石灰用量條件下施DCD 與不施DCD 處理之間上述測定指標差異顯著性。多重比較采用鄧肯（Duncan）法，差異顯著性水平為5%。通徑分析方法參考杜家菊和陳志偉[20]的報道，通過SPSS19.0進行線性回歸得到線性回歸方程的標準系數，即為直接通徑系數，再乘以自變量之間的相關系數即得間接通徑系數。

2 結 果

2.1 石灰和硝化抑制劑對土壤pH 的影響

由于尿素的水解，在培養0 d 時不施石灰處理pH 顯著高于試驗初始pH（4.8）。在整個培養期間，無論是否施用 DCD，當石灰用量從 0 增加至4 g·kg-1，土壤 pH 逐漸升高，但當石灰用量大于4 g·kg-1時，繼續加大石灰用量對土壤pH 的提升幅度較低（圖1）。在不施DCD 的條件下，培養期間各石灰用量下的土壤pH 均有下降的趨勢（圖1a））；而在施用DCD 的條件下，土壤pH 基本保持不變（圖1b））。在整個培養期間，施用DCD 較不施DCD 處理土壤pH 均顯著增加，其中，以施用2 g·kg-1石灰處理下外加DCD 對土壤pH 的提升幅度最大。

2.2 石灰和硝化抑制劑對土壤硝態氮和銨態氮含量的影響

在不施DCD 的條件下，施用石灰顯著增加土壤硝態氮含量，在培養7、14、21 d 時，施用石灰處理硝態氮含量較不施石灰處理分別增加 391.6%、127.3%和72.6%，其中以施用4 g·kg-1石灰處理對土壤硝態氮的提高幅度最大（圖2a））。隨著培養時間的增加，不施石灰和施用2 g·kg-1石灰處理的土壤硝態氮含量均在培養35 d 達到峰值，而施用4 g·kg-1和6 g·kg-1石灰處理則在培養14 d 即達到峰值，后續有降低的趨勢。在培養第35 天時，各石灰用量之間硝態氮含量無顯著差異，這可能是由于各石灰處理土壤中的銨態氮已經被完全硝化。在施用DCD 的條件下，土壤硝態氮含量在整個培養期間內僅有少量增加，始終顯著低于不施DCD 處理。不同石灰用量對土壤硝態氮含量的影響并不顯著，且均保持較低水平（40 mg·kg-1以下），意味著土壤pH 的變化對DCD 自身的抑制效果無顯著影響（圖2b））。

與硝態氮的變化趨勢相反，在不施DCD 的條件下，石灰處理土壤銨態氮含量在整個培養期間均顯著低于對照處理，其中以施用4 g·kg-1石灰處理下銨態氮含量最低，較不施石灰處理降低62%（圖3a））。隨著培養時間的增加，土壤中銨態氮含量急劇下降。培養21 d 后，除不施石灰處理外，其余處理土壤銨態氮含量均低于10 mg·kg-1，培養35d 后，各處理土壤銨態氮含量均降至3 mg·kg-1左右（圖3a））。在施用DCD 的條件下，不同石灰用量之間銨態氮含量差異不顯著，且整個培養期始終維持在100 mg·kg-1以上，顯著高于不施DCD 處理，進一步證明了DCD 對硝化作用的抑制效果不受土壤pH 變化的影響（圖3b））。

2.3 石灰和硝化抑制劑對土壤表觀硝化率的影響

在不施DCD 的條件下，施用石灰顯著提高培養7～21 d 期間土壤的表觀硝化率。在培養7 d 時，在三種石灰用量中，4 g·kg-1石灰處理表觀硝化率最高，其次為6 g·kg-1石灰處理，最低為2 g·kg-1石灰，而在培養14 和21 d，三種石灰用量之間土壤表觀硝化率無顯著差異；在培養35 d 后，各處理表觀硝化率均達到98%以上（表2）。在施用DCD 的條件下，不同石灰用量對土壤表觀硝化率無顯著影響，且均維持在較低水平（<30%），顯著低于不施DCD處理（表2）。

表2 石灰和DCD 處理下的土壤表觀硝化率Table 2 Effects of lime and DCD addition on apparent soil nitrification rate/%

進一步分析了施用石灰引起的土壤pH 變化與表觀硝化率之間的相關性。結果表明，在培養第7、14、21 天，若不添加DCD，土壤表觀硝化率隨土壤pH的增加呈現先增加后降低的拋物線趨勢（圖4）。培養第7、14、21 天的表觀硝化率均在pH 6.9 左右達到峰值，峰值分別為72.2%、99.1%和98.8%。若添加DCD，土壤表觀硝化率不受土壤pH 影響（圖4）。

2.4 石灰和硝化抑制劑對土壤 AOA 和 AOB amoA 豐度的影響

在培養35 d 后，在不施DCD 的條件下，AOA 的豐度隨著石灰用量的增加逐漸降低（圖5a）），而石灰的施用卻顯著增加了土壤中AOB 的豐度（圖5b））。DCD 的添加僅在未施用石灰的條件下顯著降低AOA 的豐度，而在施用石灰的條件下對AOA 豐度無顯著影響（圖5a））。相反，DCD 的施加在各石灰用量條件下均造成了AOB 豐度的大幅度降低。由此證明，在低pH 條件下，DCD 可同時抑制AOA 和AOB 的數量，而在高pH 條件下，DCD 主要通過抑制AOB 的數量以抑制硝化。

通徑分析一方面可以確定自變量與因變量之間的直接關系（直接通徑系數），同時也可確定自變量1 通過影響自變量2 而對因變量產生的間接影響（間接通徑系數）[20]。由此可從直接影響和間接影響兩方面深入研究自變量與因變量之間的相關性。土壤硝化作用主要由AOA 和AOB 來主導，二者可以單獨或者聯合來控制土壤硝化作用。在添加DCD 的條件下，土壤硝化作用很弱。通過通徑分析進一步分析了在不添加DCD 的條件下AOA 和AOBamoA基因豐度對7、14、21 d 土壤表觀硝化速率的影響（表3）。在不添加DCD 的條件下，AOA 豐度對土壤表觀硝化率的直接影響為負值，意味著隨著AOA 豐度的增加，土壤表觀硝化率降低，但二者之間相關性在統計學上并不顯著。同時，AOA 豐度也通過負面影響AOB 的豐度而間接降低土壤表觀硝化率；相反，在培養14 和21 d 后，AOB 豐度直接影響表觀硝化速率，且呈現顯著正相關關系（表3）。這些結果進一步證明石灰誘導的酸性紅壤硝化作用增強是由AOB 所主導。

3 討 論

3.1 石灰和DCD 對紅壤酸化的影響

本研究表明，無論是否添加DCD，當石灰用量小于4 g·kg-1時，土壤pH 隨石灰用量的增加顯著增加，而當石灰用量大于4 g·kg-1時，繼續增施石灰對土壤pH 的提高并不顯著（圖1）。這可能是因為石灰可以在短時間內中和土壤中的H+，對提高土壤pH有很強的瞬時效果，隨后由于土壤自身的緩沖作用，當到達土壤緩沖的臨界值時，繼續增加石灰用量不會造成土壤pH 的進一步增加[21]。同時本研究也發現，在不添加DCD 的條件下，隨著培養時間的延長，石灰對土壤pH 的提高效果有逐漸降低的趨勢（圖1），這與前人[21-22]的研究結果相似。其原因可能是由于施用石灰增強了土壤硝化作用，從而增加了H+的釋放[7]。在添加DCD 的條件下，在整個培養期間土壤pH 一直保持穩定且始終高于不加DCD 處理。在施用2 g·kg-1石灰的條件下，添加DCD 處理的土壤pH 可基本與施用4 g·kg-1石灰處理相持平，這與劉源等[23]的研究結果相似。充分說明DCD 可通過抑制銨態氮的硝化過程以減緩酸化進程。因此，在酸性土壤改良的過程中，不僅需要添加石灰提高土壤pH，還需從源頭抑制硝化作用，進行酸化阻控。

表3 不施DCD 條件下對土壤AOA、AOB 豐度與表觀硝化率的通徑分析Table 3 Path coefficient analysis of the amoA gene copies in ammonia oxidizing archaea and bacteria and apparent nitrification rate without DCD

3.2 石灰用量對紅壤硝化作用的影響及其機制

硝化過程是對pH 高度敏感的生物學過程[16]。施用石灰在大幅度提高酸性紅壤pH 的同時，也顯著影響硝化反應的進行。在本研究中，土壤表觀硝化率在土壤pH 為7 左右時達到峰值，之后隨著土壤pH 的增加，表觀硝化率呈現降低趨勢（表2）。這與Bramley 和White[24]的研究結果相似。究其原因主要有以下兩點：（1）pH 的升高會促進氨揮發的發生，當pH 達到7 左右時，繼續提高土壤pH 勢必會造成更多的氨揮發損失，進而降低底物濃度；（2）高pH 有可能會抑制硝化細菌的活性。Bramley 和White[24]研究發現，土壤硝化細菌活性在土壤pH 6.0附近達到最高，其后隨著pH 的增加而降低。本研究也同樣發現，隨著pH 的增加，AOA 豐度持續降低，AOB 豐度先增加后趨于平緩（圖5），與土壤表觀硝化率高度相關，進一步證明高pH 環境對硝化微生物的抑制作用。但是，也有研究表明，將初始pH 為7.24 的紫色土用石灰調節至pH 為7.70，在培養18 d 后，表觀硝化率仍顯著增加[19]。一方面，在他們的研究中，施氮量為500 mg·kg-1土，遠高于本試驗施氮量（200 mg·kg-1土），因此底物濃度不會成為該試驗中硝化過程的限制因子；另一方面，他們所采用的供試土壤初始pH 較高（7.24），其中的硝化微生物很可能已經適應高pH 環境，繼續提高土壤pH 則不會抑制其數量和活性。由此可見，對于不同土壤、不同培養環境，達到硝化作用峰值所對應的土壤pH 也不盡相同，這可能與添加的底物濃度、土壤初始pH 及初始硝化微生物數量和活性有關。

本研究中發現，酸性土壤中增施石灰所引起的硝化作用增強主要是由于AOB 豐度的增加，這與眾多其他研究結果相似[7，25-26]。與前人研究結果不同的是，在本研究中，由于AOA 的喜酸特性[27]，AOAamoA基因豐度隨著石灰用量的增加持續降低，而在Teutscherova 等[28]的研究中，施用石灰后土壤中AOA 和AOBamoA基因豐度均顯著增加，造成差異的原因可能與供試土壤中氮素礦化過程有關。AOA主要利用土壤有機氮礦化釋放的少量NH3生長，在Teutscherova 等[28]的研究中，供試土壤有機碳含量較高（25.8 g·kg-1），為氮素礦化過程提供了充足碳源。隨著pH 的增加，土壤中有機氮的礦化過程增強，NH3顯著增加，從而促進了AOA 的生長。而在本研究中，土壤有機碳含量較低（8.9 g·kg-1），很可能限制了氮素礦化過程的發生，進而對AOA 的生長無促進作用。

3.3 添加DCD 對紅壤硝化作用的影響及其機制

本研究中，在不施用石灰的條件下，添加DCD與不施DCD 處理相比表觀硝化率顯著降低，且降低幅度始終保持在 70%左右，證實了 DCD 在抑制酸性紅壤硝化過程中的有效性。這與諸多前人[29-30]研究結果相同。其原因主要是由于DCD 在酸性條件下顯著降低了AOA 和AOB 豐度。但是，諸多研究指出，由于DCD 極易溶于水且移動性較強，降雨會導致其在土壤中發生淋溶損失，減弱其抑制作用[31]。此外，也有研究表明，DCD 在高溫下降解較快，在熱帶地區不適合采用DCD 作為硝化抑制劑[32]。本研究在室內開展，無法完全模擬實際生產中的水熱條件。紅壤地區多集中于我國東南丘陵區，降雨量大，水熱資源豐富，因此，DCD 田間的實際效果尚需進一步驗證。

3.4 石灰與DCD 配合施用對紅壤硝化的作用效果

在酸性土壤中，抑制銨態氮向硝態氮的轉化對提高酸性土壤氮素利用效率具有重要意義。盡管一般情況下酸性土壤本身的硝化作用較弱，但在生產過程中，人們通常會施用石灰以提高土壤pH，保證作物產量，由此間接促進了土壤中的硝化過程。傳統的硝化抑制劑DCD 能否在石灰改變pH 的條件下始終有效抑制硝化是當前紅壤區生產中亟需解決的問題。本研究發現，與不施 DCD 對照相比，施用DCD 在各石灰用量條件下均有效抑制了紅壤硝態氮的產生（圖2），顯著降低了表觀硝化率，且各石灰處理間表觀硝化率無顯著差異（表2），充分說明DCD 的抑制效果不受土壤pH 升高的影響。與本研究結果不同的是，史云峰等[32]在海南的磚紅壤上研究發現，用石灰調節pH 后，DCD 的硝化抑制作用隨pH 的升高而降低。此外，最近的研究發現，DCD在pH 較高的潮土和水稻土上對硝化作用的抑制效果較明顯，而在酸性紅壤上的抑制效果較差[14]，也表明DCD 對硝化作用的抑制效果依賴于土壤pH，這與本文結果也有所不一致。DCD 施用量的不同可能是造成結果差異的主要原因。在本研究中，DCD用量為20 mg·kg-1土，為史云峰等[32]DCD 用量的兩倍，早有研究表明，DCD 用量越大，其抑制效果越佳[33]。因此，需保證 DCD 的較高施用量，以維持較好的抑制效果。

進一步探究DCD 的作用機理發現，在不同石灰用量條件下，DCD 對硝化作用的抑制機理也不同。在施用石灰的條件下，DCD 主要通過抑制AOB 的數量達到抑制效果。這與諸多研究[34]結果相似。原因一方面是由于AOA 的數量已經被堿性環境強烈抑制，另一方面可能是由于基本代謝和細胞之間的差異，細菌相對古菌更容易受到抑制物的影響[16]。而在不施石灰的條件下，DCD 對AOA 和AOB 的豐度均有顯著抑制作用（圖5），意味著在酸性條件下，DCD 可能是通過同時抑制AOA 和AOB 來抑制硝化作用。這與Robinson 等[26]的結果相同，說明在不同石灰用量（即不同pH 條件下），DCD 主要通過抑制環境中的主導硝化微生物菌群的生長，從而抑制硝化過程。

4 結 論

通過短期土壤培養試驗，本文研究了不同用量石灰和硝化抑制（DCD）對紅壤pH 和硝化作用的影響及其機制。結果發現：（1）施用石灰可以短期顯著提高紅壤的pH，但隨著培養時間的延長，石灰對紅壤 pH 的提高效果有逐漸降低的趨勢。施用DCD 可通過抑制硝化過程提高土壤pH，減緩土壤酸化；（2）紅壤表觀硝化率隨土壤pH 的增加呈現先增加后降低的趨勢。在土壤pH 為6.9 左右時，表觀硝化率達到峰值。DCD 對硝化作用的抑制效果不受土壤pH 影響；（3）施用石灰提高紅壤pH，進而增強硝化作用，其主要是由AOB 所主導。低pH（pH< 6.0）條件下，DCD 對AOA 和AOB 均有顯著抑制作用，而在高pH（pH 7.0～7.8）條件下，DCD 主要抑制AOB，而對AOA 的影響并不顯著。這些結果表明，在酸性紅壤上，石灰和DCD 相結合施用，不僅可以提高土壤pH，減緩土壤酸化，而且可以抑制土壤硝化作用。上述研究結果為酸性紅壤改良利用和氮肥施用管理提供了理論支持。