不同染料標識木栓細胞壁中木栓脂的分布

張 寶，陳冰煒，翟勝丞,2*，潘 彪，魏建強，勇 強

(1.南京林業大學 材料科學與工程學院，江蘇 南京 210037；2.南京林業大學 林業資源高效加工利用協同創新中心，江蘇 南京 210037；3.南京林業大學 化學工程學院，江蘇 南京 210037)

木栓細胞(phellem cell)，即軟木細胞(cork)[1]，其細胞壁主要成分為木栓脂(suberin)、木質素(lignin)、多糖(polysaccharide)等高分子聚合物[2-3]；如栓皮櫟軟木中木栓脂的質量分數約40%[4-5]。木栓脂化學性質比較穩定，具有較好的耐腐性和耐老化性。目前軟木的主要應用是通過與其他材料復合以制備板材，可賦予板材一定吸振、吸聲的功能，可滿足公共場所和家庭場所的減噪需求[6]；木栓脂可通過己酸膽堿催化解聚以最大程度的保留木栓脂的分子完整性、進而加工制成具有一定程度的抗菌性、防水性的薄膜，具有良好的應用前景[11]。

木栓脂化學結構與木質素有較大不同，因此可通過不同染料對于化學組分的特異性染色來進行區分。染色對觀察生物材料的組織結構、化學組分分布等至關重要，將生物材料進行染色，可以對細胞或細胞壁中的某特定化學物質進行染色，以觀察該化學物質在細胞或細胞壁中的分布。如K.Kobayashi等[7]使用甲苯胺藍對日本晚櫻栓質化細胞進行染色，觀察到木質素主要存在于栓質化細胞的細胞壁內側部分。

根據前人研究，植物細胞染色常用染料有甲苯胺藍[7]、硫酸氫黃連素[8]、番紅O、固綠[9]、蘇丹類染料[10]、間苯三酚顯色反應[11-12]等，適用于木質化或者栓質化細胞的染色[13]，但是如何區分細胞壁層中木質化和栓質化部分，仍有待摸索。日本晚櫻樹皮中的木栓細胞具有較好的柔韌性，且細胞在弦向可伸長至原始尺寸的2到3倍[7]。本研究采用了蘇丹Ⅲ染色法、蘇丹紅7B染色法、甲苯胺藍染色法、硫酸氫黃連素-苯胺藍對染法和鹽酸-間苯三酚染色法五種染色方法對日本晚櫻樹皮切片進行染色，采用光學顯微鏡(含熒光顯微鏡)進行觀察，確定木栓細胞在樹木周皮中的分布及木栓脂在木栓細胞不同壁層的分布。通過比較不同染色方法，開展日本晚櫻(Cerasusserrulata)樹皮中栓質化細胞壁主要化學成分分布的研究，有助于后期進一步深入了解木栓細胞在植物生長過程中的形成及木栓脂堆積的過程，掌握周皮對植物保護作用的機理。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗對象：日本晚櫻樹皮取自南京林業大學校園，從樹干上取得尺寸為10 mm×10 mm×5 mm(L×T×R)的樹皮。

染料：蘇丹Ⅲ(Sudan Ⅲ，國藥集團化學有限公司)，蘇丹紅7B(Sudan Red 7B，國藥集團化學有限公司)，甲苯胺藍O(Toluidine Blue O，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，苯胺藍(Aniline Blue，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，硫酸氫黃連素(Berberine Bisulfate，上海麥克林生化科技有限公司)，間苯三酚(Phloroglucinol，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

包埋劑：LR-white樹脂(London Resin Company Ltd)，環氧樹脂Epon812(Epon812、NMA、DDSA、DMP-30產自Structure Probe公司)。

其他：FAA固定液(磷酸二氫鈉4.0 g，磷酸氫二鈉6.5 g，37%甲醛100.0 mL，蒸餾水900.0 mL，浙江金華同和生物技術有限公司)，鹽酸(Hydrochloride，南京化學試劑股份有限公司)，聚乙二醇200(上海靈峰化學試劑有限公司)，丙三醇(國藥集團化學試劑有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 樣品包埋 環氧樹脂Epon812包埋：樣品飽水、戊二醛固定、PBS緩沖液調節pH、酒精梯度脫水、丙酮梯度脫酒精、配置樹脂、樣品包埋、樹脂聚合(37℃，過夜；45℃，12 h；60℃，24 h)。

LR-white樹脂包埋：樣品飽水、配置樹脂(向500 g樹脂中加入9.9 g催化劑，避光混合均勻)、樣品包埋(將飽水后的樣品放入樹脂中)、樹脂聚合(在65℃烘箱中進行樹脂聚合)。

1.2.2 切片制備 待日本晚櫻樹皮在FAA組織固定液中浸泡24 h后，將樹皮修成1 mm×1 mm×3 mm的小樣，分別采用LR-white樹脂和Epon812環氧樹脂進行包埋。包埋樣品經單面刀修樣后，使用半薄切片機(LEICA，RM2265)進行切片，切片厚度為3 μm。

1.2.3 染液配制及切片染色 本實驗所用染料分別為甲苯胺藍染液、蘇丹紅7B染液、硫酸氫黃連素染液、苯胺藍染液、蘇丹Ⅲ染液和間苯三酚染液，染液詳細配制方法如表1所示。染液配制好后，按照表2中的染色步驟進行染色。染色后的切片，經漂洗浮色后，進行封片。封片劑為甘油水溶液。

1.2.4 切片觀察 使用型號OLYMPUS，BX51熒光顯微鏡進行觀察。藍色激發光波長450～480 nm，拍照設備OPLENIC DIGITAL CAMEREA。

2 結果與分析

2.1 普通染料染色

分別采用甲苯胺藍、鹽酸-間苯三酚、蘇丹Ⅲ和蘇丹紅7B對日本晚櫻樹皮經環氧樹脂Epon812包埋后的切片進行染色，并采用光學顯微鏡進行觀察，顯微圖像如圖1所示。圖1a為未染色顯微圖像，圖中木栓細胞形態不規整，細胞間無細胞間隙，且相鄰細胞間的連接方式為搭接。圖1b為鹽酸-間苯三酚染色結果，間苯三酚在酸性條件下主要使木質化的細胞壁著色[14]，但在圖中并未觀察到木質素被染上顏色，這可能與包埋時所用樹脂相關。圖1c為蘇丹Ⅲ染色結果，可觀察到木栓細胞壁在染色后分為兩個部分，木栓細胞壁遠離細胞腔部分(即細胞壁外側)被染上紅色，靠近細胞腔的細胞壁(即細胞壁內側)仍為無色。蘇丹Ⅲ為脂溶性染料，易溶于脂類物質可使脂類物質著色[7]，圖1d為蘇丹紅7B染色結果，可以看到木栓細胞壁的內側部分為無色，木栓細胞壁的外側部分為紫紅色，其染色結果與蘇丹Ⅲ類似，可使木栓細胞細胞壁的木栓脂著色。

注：箭頭：木質素，箭：木栓脂，標尺=20 μm。

表1 不同染料的配制方法Table 1 Preparation of different dyes

表2 5種染色方法染色步驟Table 2 Dyeing steps

2.2 熒光染料

2.2.1 甲苯胺藍染色 甲苯胺藍作為染料既可以在明場下觀察，也可以在熒光下觀察。使用熒光顯微鏡觀察未染色、甲苯胺藍染色及硫酸氫黃連素染色效果，如圖2所示。圖2a為未染色切片在明場下的顯微圖片，可以看到徑切面上木栓細胞形態不規整。圖2b為未染色切片在藍色激發光下的顯微圖片，圖中木栓細胞熒光強度與顏色相差不大，較難區分木栓細胞壁的成分分布。圖2c為甲苯胺藍染色明場下顯微圖片木栓細胞壁的內側染上藍色，木栓細胞壁的外側著色較淺至無色。圖2d為甲苯胺藍染色切片在熒光顯微鏡下的圖片，與未染色切片在紫色激發光下觀察比較，發現木質素的熒光消失，木栓脂的熒光變暗。甲苯胺藍主要使細胞壁中木質素及多糖類物質著色[7]。蘇丹Ⅲ與蘇丹紅7B均為脂溶性染料，而木栓細胞中含有的脂類物質主要為木栓脂，因此蘇丹Ⅲ染色后顯紅色的細胞壁為木栓脂。甲苯胺藍、蘇丹Ⅲ和蘇丹紅7B染色結果均表明木栓細胞壁的內側部分主要成分為木質素和多糖，外側部分主要成分為木栓脂。甲苯胺藍染色后木質素與木栓脂的熒光均變暗，說明在藍色激發光下甲苯胺藍可以抑制木質素和木栓脂的自發熒光[15]，表明甲苯胺藍主要使木質素著色，也可使木栓脂著色但著色程度較淺。

注:a為未染色，b為未染色切片在藍色激發光下的顯微圖片，c為甲苯胺藍染色，d為甲苯胺藍染色切片在藍色激發光下的顯微圖片，箭頭：木質素，箭：木栓脂，標尺=20 μm。

2.2.2 硫酸氫黃連素-苯胺藍對染法 硫酸氫黃連素-苯胺藍對染法染色結果如圖3所示，硫酸氫黃連素-苯胺藍為熒光染色，在明場下(圖3a)較難分辨木栓脂和木質素不同。藍色激發光下硫酸氫黃連素的染色結果(圖3b)發現，木栓細胞壁的內側呈現為黃綠色，細胞壁的外側呈現為灰綠色。硫酸氫黃連素-苯胺藍染色后就染色效果與圖1b中未染色相比，染色后木質素與木栓脂的熒光得到不同程度的增強，從而觀察到木質素和木栓脂的分布。根據前人研究[16]硫酸氫黃連素-苯胺藍對染法中，硫酸氫黃連素主要使木栓脂的熒光增強；苯胺藍可作為木質素自發熒光的抑制劑[17]，在激發光下可觀察到木質素的自發熒光變暗。結合以上分析可知，硫酸氫黃連素-苯胺藍對染色法，可在增強木栓脂的熒光同時，抑制木質素的自發熒光，從而在熒光顯微鏡下區分并確定木栓細胞壁木栓脂和木質素的分布。

注:a為染色后明場下顯微圖片，b為染色后藍色激發光下的顯微圖片，箭頭：木質素，箭：木栓脂，標尺=20 μm。

2.3 鹽酸-間苯三酚染色切片改良

圖1b為使用環氧樹脂包埋后制作切片染色結果，其染色效果較差。為探究不同包埋樹脂對染色效果的影響，根據間苯三酚的化學性質，選用親水性樹脂LR-white樹脂對日本晚櫻樹皮進行包埋，切片后再次染色。發現圖4中木栓細胞細胞壁內側被染上了紅棕色，間苯三酚在酸性條件下主要使木質素著色，由此可知木栓細胞壁的內側主要成分為木質素，這與前面的染色結果相互驗證，也表明使用親水性染料染色時，LR-white樹脂包埋后切片的染色效果優于環氧樹脂包埋染色效果。鹽酸-間苯三酚染色法對環氧樹脂和LR-white兩種樹脂包埋后的切片進行染色后，環氧樹脂包埋后的切片仍為無色，而LR-white樹脂包埋后切片木栓細胞壁的內側被染上櫻紅色，表明樹脂對鹽酸-間苯三酚染色有影響，主要原因為LR-white樹脂為親水性樹脂，且間苯三酚具有羥基，因此，間苯三酚更容易作用于切片使木質素著色。

注:箭頭：木質素，箭：木栓脂，標尺=20 μm。

3 結論

染色后在明場下觀察，蘇丹Ⅲ的染色效果最好，可以直接將木栓脂染成紅色。同時結合甲苯胺藍、蘇丹紅7B和鹽酸-間苯三酚染色確定木栓脂主要存在于木栓細胞壁的最外層。

甲苯胺藍可以抑制木質素的自發熒光，避免木質素的自發熒光的干擾，直接觀察到木栓脂的熒光。

硫酸氫黃連素-苯胺藍染色后，木栓脂的熒光在木栓細胞壁外側呈灰綠色，木質素的熒光在木栓細胞壁的內側呈黃綠色。

鹽酸-間苯三酚染色后，木栓細胞壁內側的木質素呈現為紅棕色，且環氧樹脂包埋會降低鹽酸-間苯三酚的染色效果。