木質素與酶的作用機制及其在纖維素酶水解中的影響研究進展

黃麗菁，吳彩文，鄒春陽，閆雪晴，吳文娟

(南京林業大學 江蘇省林業資源高效加工利用協同創新中心，江蘇 南京 210037)

目前，全世界的能源消耗主要來自于煤炭、石油、天然氣等傳統化石能源，社會經濟的飛速發展使得人們對能源的需求不斷增加，這將導致傳統的化石燃料日益枯竭，也會帶來嚴重的環境污染問題[1]，為了解決能源供求問題，開發可再生的清潔能源已成為必然趨勢，這也將是人類社會可持續發展的重大挑戰。

木質纖維原料是目前資源最為豐富、分布最為廣泛的生物質，主要包括木材(闊葉材和針葉材)、能源植物(竹子、高粱等)、農業生產或林業加工廢棄物(如棕櫚樹干、棉繭殼、橄欖殼、玉米秸稈等)[2]，具有可再生、儲量大、價格低等優勢，可轉化為乙醇、氫氣、生物柴油等生物質燃料[3]。其中生物乙醇的生產是通過酶水解纖維原料中的纖維素、半纖維素并發酵而成的，這種生產過程取決于3個關鍵步驟，包括預處理、酶水解以及將釋放的糖進行發酵[4]，而預處理作為其中的關鍵環節對后續的酶水解有著重要的影響。

在木質纖維原料的處理過程中，木質素的存在使得木質纖維原料對纖維素酶水解具有頑抗性，導致細胞壁的3個主要成分(木質素、纖維素和半纖維素)難以有效的解離，從而導致酶水解效率的降低[5]。因此，研究木質素的結構特點有助于降低纖維原料的頑抗性，實現更高效的酶水解，也為開發經濟高效的新型預處理技術提供了方法和技術支撐[5-6]。

目前，關于木質素對酶水解影響的研究有很多，但由于木質素結構的復雜多樣性以及預處理對木質素結構的改變使得難以獲得統一而確定的木質素對纖維素酶無效吸附的機理[7]。本文擬對纖維素酶水解的影響因素進行介紹，并綜述木質素與酶之間的作用機理及其在纖維素酶水解中的影響研究進展。

1 木質纖維原料

1.1 組成與結構

木質纖維原料主要含有纖維素、半纖維素、木質素等，木質纖維原料來源不同，組成含量也不同[8]。通常，木質纖維素原料中纖維素、半纖維素和木質素的含量分別在30%～60%、20%～40%和15%～25%[9]。

纖維素是由葡萄糖組成的多糖聚合物，通過β-1-4糖苷鍵緊密連接，其聚合度在500～10 000。由于纖維素分子間的氫鍵作用，纖維素分為結晶區和無定形區，結晶區氫鍵排列規則緊密，無定形區氫鍵排列松散且沒有規則。分子間的氫鍵連接是具有不同取向性的，因此產生了不同程度的結晶度。結晶度在纖維素的生物降解過程中起著至關重要的作用，一般來說，結晶度越高，纖維素的生物降解就越困難[10]。

半纖維素是由2種及以上的糖基組成，往往帶有不同數量的支鏈或側鏈。木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖和甘露糖等是組成半纖維素的主要糖基，它們根據半纖維素的來源以不同的比例排列。針葉材中的半纖維素以己聚糖為主，闊葉材中的半纖維素以戊聚糖為主。半纖維素分子量低，具有無定形區，比纖維素更易溶解，也更易受到化學攻擊[11]。

木質素廣泛存在于維管植物中，是由苯丙烷單元通過化學鍵連接而成的芳香族聚合物，作為粘合劑存在于胞間層與微纖絲之間，從而增強了細胞壁的結構[12]。構成木質素的結構單元主要有對-羥苯基結構(H)、愈創木基結構(G)和紫丁香基結構(S)3種，但不同來源的木質素結構差異有很大不同。這3種結構單元如圖1所示。

圖1 木質素3種結構單元[13]

一般來說，針葉木木質素含有豐富的G結構單元，闊葉木木質素同時包含G型和S型2種結構單元，而禾草類木質素則由G、S、H這3種結構單元構成[14]。因此根據所含結構單元的不同，木質素可進一步分為G型(針葉木木質素)、G-S型(闊葉木木質素)、G-S-H型(禾本科木質素)、G-H型(應壓木木質素)[15]。表1為3種結構單元在不同種類植物中的含量[16]。

表1 不同種類植物中的木質素結構單元含量

1.2 木質素的來源與應用

木質素的分離方式一般有2種：1)溶出木質素，木質素降解為可溶性碎片從原料中分離出來；2)保留木質素，纖維素、半纖維素降解溶出，木質素作為固體殘渣被保留下來[17]。根據分離方法的不同，木質素可分為磨木木質素(Milled Wood Lignin，MWL)、堿木質素、酶解木質素、木質素磺酸鹽等。

磨木木質素又稱Bj?kman木質素[18]。磨木木質素是使用中性溶劑在無酸、無熱的條件下進行提取。此方法的得率較低，但其化學結構未受到嚴重的破壞，與原木質素具有最相似的結構，經常被用于木質素化學結構的研究。

堿木質素是燒堿法或硫酸鹽法化學制漿的副產物[19]，往往含有大量的小分子糖、提取物和無機鹽等雜質，因此常用堿溶酸析法進行提純[20]。經過提純改性后的堿木質素可用于復合材料、橡膠等領域。

酶解木質素源自于生物乙醇的生產過程中的酶解殘渣，通過有機溶劑或堿溶酸析法分離提取獲得。它的結構與磨木木質素相似，但得率更高。由于酶解木質素未經過高溫高壓及酸堿的處理，保留了良好的天然結構，含有豐富的酚羥基，可作為在酚醛樹脂中苯酚的替代物[21]。

木質素磺酸鹽來源于亞硫酸鹽制漿工藝。它能夠溶解于一定pH的水溶液中，卻不溶于大多數溶劑[22]。木質素磺酸鹽具有良好的分散性和表面活性，可以被用作混凝土外加劑、染料分散劑，以及用于工業廢水中重金屬吸附的乳化劑和螯合劑[23]等。

2 木質纖維原料的預處理

木質纖維素結構復雜，纖維素周圍被半纖維素和木質素形成的緊密的空間網狀結構包裹。這種物理屏蔽阻礙了纖維素與外界的接觸，也阻礙了纖維素的酶降解。為了增大原料的比表面積和提高酶對底物的可及性，改善纖維素的酶解效率，選擇適當的預處理方式是必不可少的方法。一方面，可以破壞木質素和纖維素、半纖維素之間的連接，減少木質纖維素的頑抗性[24-25]；另一方面，在一定程度上破壞了纖維素結晶度，增加原料的孔隙度和比表面積，改善了纖維素對酶的可及性[26]。

目前，常用的木質纖維素預處理的方法有物理預處理，如機械粉碎法[27]、微波法[28]等方法；化學預處理，如酸法[29]、堿法[30]、有機溶劑法[31-32]、離子液體[33-34]等；物理化學預處理，如氨纖維爆破預處理[30]、蒸汽爆破預處理[35]等；生物預處理，如微生物預處理等[36-38]。每種方法都有其優缺點，可根據實際生產情況進行選擇。

3 纖維素酶水解的影響因素

在木質纖維素原料酶水解中，影響纖維素酶水解的因素有很多，包括纖維素酶和酶水解條件、酶的可及性、底物對纖維素的包覆等因素。纖維素酶是能夠將纖維素降解為葡萄糖的酶的總稱，分為內切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶β[39]。在一定的纖維素酶濃度范圍內，酶解效率會隨著纖維素酶濃度的增加而提高。T.Kinnarinen等[40]在研究磨碎的廢棄硬紙箱的酶解過程中發現纖維素酶的濃度在很大程度上決定著還原糖的產率，但酶的用量也不是越多越好，當濃度達到一定程度時，水解速度的增加會變得緩慢。

當纖維素酶的濃度適宜時，其催化反應還需要在合適的溫度以及pH值范圍內進行。Jon等[41]在模擬溫度、酶和生物量負荷對糖產量影響時發現，在較低的溫度和較低的酶負荷下纖維素更易轉化為葡萄糖。通常情況下，纖維素酶水解最適宜的溫度在40℃～60℃。pH值最適宜的范圍在4.5～5.5。但也有研究表明[42]，pH值>5.5會促進木質纖維素的酶解效率。

底物對纖維素酶水解也有著重要的影響，主要體現在纖維素的結晶度、纖維素可及比表面積以及木質素和半纖維素的空間阻礙等方面。在水解過程中纖維素酶首先水解纖維素中較易接近的無定形區，有研究表明[43]，破壞纖維素的晶體結構可增加其可及度從而加速纖維素的水解。酶對纖維素吸附量的大小往往由可及比表面積的大小決定，當底物的孔隙足夠大時，通過纖維素酶系統的協同作用，可顯著提高纖維素酶水解的效率[30]。增加可及比表面積還可以通過去除半纖維素和木質素的方式來增加木質纖維素原料的孔徑和可及比表面積，減少酶的非生產性吸附，提高木質纖維原料的酶水解效率[44]。

3.1 木質素—酶相互作用的機制

許多研究表明，木質素對木質纖維原料的酶水解有著顯著的抑制作用。盡管研究者已經對木質素和水解酶之間的相互作用做了大量的工作，但對這些相互作用背后的機制仍然不夠清楚。目前認為酶水解中木質素的抑制作用主要來源于：1)木質素引起的非生產性吸附；2)木質素的空間結構[45]。

3.1.1 非生產性吸附 纖維素酶和木質素之間的非生產性吸附主要與疏水作用[46]、靜電作用[47]、氫鍵作用[48]有關。

3.1.1.1 疏水作用 疏水作用指的是酶結構中的芳香性氨基酸的殘基與木質素表面疏水基團的結合。纖維素酶中碳水化合物結合域和木質素之間的疏水作用被認為是纖維素酶催化木質素非生產性結合的主要原因。除了碳水化合物結合域以外，纖維素酶催化域上的疏水區域也被認為會導致對木質素的吸附[49]。K.T.Hodgson等[50]測量了木質素和纖維素的接觸角，發現木質素的接觸角大于纖維素的接觸角，說明木質素的疏水性高于纖維素，當木質素與纖維素同時存在時，纖維素酶會優先吸附木質素。

3.1.1.2 靜電作用 雖然疏水作用是主要的驅動力，但靜電作用對蛋白質在固體表面的吸附行為也起著重要的作用。水相環境中官能團(如木質素的羧基、羥基、酶的氨基酸殘基)的締合、解離會使木質素和酶產生表面電荷，從而引起它們之間的靜電相互作用[51-52]。在水溶液中，木質素的基團(羥基和羧基)會發生電離使其表面帶有負電；而纖維素酶表面有許多暴露在外的氨基酸殘基，這是一種兩性基團，它所帶的電荷性質會隨著pH條件的變化而改變[45]。例如，當等電點一定時，β-葡萄糖苷酶在pH<5.5時帶正電，幾乎完全吸附帶負電的木質素；而當pH值增加到6.0時，β-葡萄糖苷酶對木質素的吸附能力顯著降低。但對于外切型葡聚糖酶和內切型葡聚糖酶來說，pH的變化對木質素-酶相互作用的影響并不明顯，因為這2種酶的等電點均<5.0，并且在其應用pH值范圍5.0～6.0顯示出負電荷[53]。

3.1.1.3 氫鍵作用 氫鍵作用是通過木質素和酶中的羥基發生的，在這些基團中，酚羥基直接負責酶的吸附，而脂肪族和羧基羥基被認為有助于木質素-酶的離子相互作用[54]。目前對木質素與纖維素酶之間的氫鍵結合的研究較少，因此需要進一步研究氫鍵對木質素-酶相互作用的影響。

3.1.2 空間位阻 除了酶的非生產性吸附外，木質素還可以通過空間位阻來抑制纖維素水解。在木質纖維原料預處理的過程中，木質素可以遷移到纖維表面，導致整個生物量基質重新分布；也可以通過溶解的木質素重新凝聚形成液滴沉積在纖維素表面，阻礙酶在纖維表面的吸附，進一步抑制纖維素的水解[46]。J.K.Ko等[55]在高溫液態水預處理混合闊葉木的過程中，用電鏡掃描觀察了在細胞壁表面形成的球形液滴，發現這些液滴主要是疏水性的木質素，它們沉積在纖維素表面阻礙了水解，直觀地解釋了空間位阻對纖維素酶水解的影響。

3.2 木質素結構單元對纖維素酶水解的影響

木質素結構單元的差異，直接影響木質素的分子結構，是木質素大分子結構差異的最主要的因素。木質素的組成因素對酶解過程中有著顯著影響，被認為是酶水解的障礙，而在組成因素中，S/G比是研究最多的因素之一。S/G比之所以能影響酶水解，是因為它會影響木質素交聯，進而影響植物細胞壁的三維結構和酶的纖維素可及性。

許多研究者發現，S/G比與酶對木質素的吸附量呈負相關，但與纖維素水解產量呈正相關。例如，M.H.Studer等[56]在對楊樹樣本研究的過程中發現，較高的S/G比意味著較高的脫木素率，由于高S/G比的木質素中不穩定的β-O-4鍵所占比例較高，導致它更容易進行預處理。因此在這種情況下，木質素更易水解。J.K.Ko等[53]經過研究發現,G單元含量高的木質素能吸附更多的纖維素酶，尤其是β-葡萄糖苷酶，木質素對β-葡萄糖苷酶的吸附間接抑制了闊葉木中纖維素的酶解，表明木質素的S/G比在纖維素酶吸附木質素和生物質水解中的重要性。J.E.Kim等[57]研究了在相同反應條件下，草酸和硫酸催化劑對稀酸預處理生物質中木質素結構變化的影響。實驗中發現，在草酸預處理的生物質中，由于G型木質素的含量較高，導致其對酶解效率有負面的影響。在比較酶在馬尾松木質素膜與麥草、楊木木質素膜上的吸附量時，發現酶在馬尾松木質素膜上的吸附量更高。而馬尾松、麥草、楊木的S/G比分別為0、0.5、1.47，因此這一結果可以證明G單元含量越高，吸附量越大[58]。

然而，關于S/G比對于纖維素酶水解的影響還存著一些不同的結論。一些研究發現，S/G比與未經處理的木質纖維原料的酶水解呈負相關。在磨木木質素對纖維素酶的吸附實驗中，L.P.Tan等[59]發現經過酸性亞硫酸鹽預處理的磨木木質素顯示出更高的S/G比以及更高的酶吸附能力。在研究桉樹3個突變體及相應野生型在離子液體預處理前后對纖維素水解能力的影響時，G.Papa等[60]發現，高S/G比木質素會導致葡萄糖產率降低(r=0.97；P<0.03；n=4)，但不影響離子液體預處理后的葡萄糖產率。這是由于離子液體預處理的高效性掩蓋了S/G比值改變的影響。也有一些研究表明，生物原料的水解能力不受S/G比的影響。為了研究S/G比對苜蓿酶促水解的影響，B.S.Dien等[61]創建了轉基因苜蓿，這種苜蓿的S單位含量低于野生型苜蓿，經過實驗未發現S/G比對經過稀酸預處理的苜蓿的酶水解有顯著影響。N.A.Tobimatsu等[62]培育出了G、S、H單元含量較高的木質素，經過實驗發現，G、S單元的含量對纖維素酶水解的影響幾乎為零，而H單元的增加對纖維素酶水解有促進作用，它所產生的葡萄糖幾乎是從前的2倍，因此研究者認為，與G和S單元的含量相比，木質素結構中醛基的含量才是酶水解的決定性因素。

由于H單元在木材中的含量較少，對于H單元對纖維素酶水解的影響的研究較少。有數據表明，H單體可能與β-1-4-葡聚糖鏈而不是半纖維素連接，從而導致小麥和水稻中纖維素結晶度降低，因此H/G對水稻和小麥木質纖維素糖化有積極影響[63]。H單元之所以會產生積極作用，可能是因為木質素分子量降低、纖維素結晶度由于H單元與葡聚糖鏈的連接而降低或者是H單元的結合活性高于G、S單元[64]。F.F.Guo等[65]卻在試驗中發現木質素中H單元的濃度可能對吸附量沒有影響。松木木質素和白楊木質素幾乎含有相等的H單元，松木木質素的吸附量大于白楊木質素。秸稈木質素比松木木質素具有更多的H單元和較弱的親和力，紅麻木質素比白楊木質素和松木木質素具有更多的H單元和較弱的吸附能力，說明H單元數量的增加并沒有增加吸附能力。秸稈木質素比紅麻木質素具有更多的H單元和更大的親和力，說明H單元數量的增加也沒有降低親和力。這些結果表明，H單元的數量可能與吸附能力無關。

4 展望

酶水解是利用木質纖維原料生產生物乙醇的重要途徑，而木質素通常被認為對木質纖維原料的酶水解有著顯著的抑制作用。近年來，隨著各種技術的綜合利用以及新技術的開發，針對木質素對纖維素酶水解的影響的研究越來越多。在木質素對酶水解或酶吸附的研究中，由于木質素結構不同的底物，其生物構造、化學組分的構成、分子結構和超分子聚集態等也各不相同，傳統的研究方法通常只能間接推測木質素對酶的吸附及對底物酶水解的影響。這也是目前對木質素結構如何影響酶水解存在不同觀點的重要原因。如何消除非木質素因素的干擾，是解決這一難題的關鍵所在。未來的工作可以考慮制備具有不同單元構成的木質素樣品，運用先進的技術，如耗散型石英晶體微分析天平，進行原位、實時研究不同結構單元的木質素，以及纖維素復合物在酶吸附和/或酶水解動態行為，在排除其他干擾因素(即除木質素結構不同，其他條件完全相同)的條件下，深刻認識木質素單一因素的影響，構建木質素結構單元與纖維素酶吸附及其對酶水解糖轉化的“構-效”關系，為改進現有預處理方法及開發新的高效的預處理方法提供理論依據和技術支持，并有助于提高木質纖維素的酶解效率，實現以木質纖維素為原料進行生物乙醇高效轉化的工業化生產。