NADPH氧化酶與線粒體的相互作用調控糖尿病大鼠視網膜細胞突觸連接的機制

趙 霞，李 培，湯麗瑩，茹 靜，王 晶

（首都醫科大學附屬北京朝陽醫院綜合科，北京 100043）

糖尿病性視網膜病是高血糖引起的微血管并發癥［1，2］。由于mtDNA與產生ROS的位置非常接近，并且mtDNA中沒有像核DNA一樣有效的DNA修復系統，因此mtDNA非常容易受到ROS的攻擊［3］。DM中存在的高血糖環境會導致ROS產生增加，DNA損傷以及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）水平降低［4-6］。煙酰胺單核苷酸腺苷酸轉移酶1（NMNAT1）是所有生物中的核酶，在再循環途徑中對NAD合成至關重要，調節NAD依賴性酶的功能［7-9］。作為Bcl-2家族成員，抗凋亡因子Bcl-2和Bcl-xL與促凋亡因子Bax調節線粒體途徑的平衡，該平衡決定糖尿病刺激后視網膜細胞的存活［10］。

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 大鼠視網膜細胞分離篩選30只雄性Wistar大鼠（C57BL / 6J），使用鏈脲佐菌素誘導糖尿病大鼠模型，干預時程為4個月。

1.1.2 實驗分組大鼠隨機分為3組：對照組（正常飼養同齡的大鼠，n=10），觀察組（使用鏈脲佐菌素誘導糖尿病大鼠模型，n=10），治療組（胃部進行牛磺酸注射治療，n=10）。通過頸脫位法處死大鼠、分離眼球、收集視網膜，用D-Hank溶液洗滌，切成1×1 mm小塊，0.25%胰蛋白酶溶液中37°C孵育30min，30μm尼龍篩過濾，1000 rpm離心5min沉淀，接種Dulbecco改良Eagle培養基和20%胎牛血清的培養瓶，37°C培養。

1.2 方法

1.2.1 組織學在含有0.1%Triton X-100的PBS中將視網膜切片（厚度為8～10μm）透化5min，0.1%Tween 20和0.1%疊氮化鈉在室溫下放置2h。一抗室溫孵育2h。在4℃溫育12h期間，用花生凝集素凝集素對視錐細胞感光體的內部/外部片段進行染色，添加染料二酰胺二苯基吲哚（DAPI），沖洗、固定，使用數字病理系統掃描的整個垂直切片對PNA，Brn-3a和GFAP標記的切片進行計數。

1.2.2 蛋白質印跡分析測定蛋白質濃度，等量的蛋白質溶解在SDS-聚丙烯酰胺凝膠，電泳轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。……