基于網絡藥理學研究膽舒膠囊治療慢性膽囊炎的機制

馮煒業 柯璐琳

慢性膽囊炎為相當常見的消化系統疾病，多由膽結石所致膽囊壁炎癥，或膽汁瘀積、感染導致急性膽囊炎反復發作拖延不愈而致[1]。這幾年，中醫藥在醫治慢性膽囊炎上發揮了重要作用，在一定程度上補充了西藥治療療效不佳的情況。

膽舒膠囊中主要活性成分為薄荷素油，其為新鮮的唇形科薄荷的莖和葉經一系列加工獲得的揮發油。薄荷是傳統的食藥兩用植物，具有抑菌、抗炎、止痛、抗癌、解痙等生物活性，臨床上可將其為單方或復方治療慢性膽囊炎，但在薄荷治療慢性膽囊炎的分子機制上的研究報道甚少。本文基于網絡藥理學方法，篩選出膽舒膠囊中君藥薄荷的主要有效活性成分和發揮作用的靶點，探究慢性膽囊炎的已知疾病靶點，分別繪制PPI及“薄荷-有效活性成分-交集治療靶點-疾病”網絡圖，并進行分析；依托Bioconductor數據庫，運用R語言軟件及clusterProfiler等數據包對靶點基因本體(GO)的生物進程(BP)、分子功能(MF)、細胞成分(CC)3個水平及KEGG信號通路進行分析，為膽舒膠囊治療慢性膽囊炎分子機制的進一步探索提供參考。

1 材料

TCMSP數據分析平臺；Pubchem數據庫；Swiss target predict數據庫；GeneCards數據庫；OMIM數據庫；Uniprot數據庫；String數據庫； Venny 2.1.0軟件； Cytoscape 3.7.2軟件；Bioconductor數據庫；R語言軟件；clusterProfiler等數據包等。

2 方法

2.1 主要活性成分及作用靶點的篩選基于TCMSP平臺，“薄荷”為關鍵詞，選擇口服生物利用度(OB)≥30%并且類藥特性(DL)≥0.18作為篩選條件[2]，同時結合楊倩[3]的報道，獲得相關的化合物成分。將篩選后的化學成分導入Pubchem服務器，得到化學成分2D結構的SDF文件。最后，運用Swiss target predict數據庫，導入化學成分的SDF文件，選擇物種為“智人”，選擇Probability值>0的靶點，剔除未獲得靶點的成分，剔除重復靶點，獲取活性成分靶基因，并經過Uniprot蛋白數據庫對靶基因進行注釋。

2.2 疾病靶點的收集分別在GeneCards及OMIM數據庫、以“chronic cholecystitis”為關鍵詞，搜集與慢性膽囊炎發病的相關靶基因，合并2個數據庫疾病靶點，剔除重復值，獲得慢性膽囊炎疾病靶點。

2.3 PPI網絡圖的繪制與分析運用 Venny 2.1.0軟件將薄荷活性成分靶點與慢性膽囊炎疾病靶點進行交集，得到膽舒膠囊醫治慢性膽囊炎的治療靶點。將獲得的治療靶點上傳String在線數據庫，得到蛋白互作網絡，并對網絡圖中的核心基因進行分析。

2.4 “薄荷-有效活性成分-交集治療靶點-疾病”網絡圖的構建將薄荷、有效活性成分、交集治療靶點、疾病間相互關系導入 Cytoscape 3.7.2軟件，構建“薄荷-有效活性成分-交集治療靶點-疾病”網絡圖。

2.5 GO與KEGG富集分析依托Bioconductor數據庫，R語言軟件及clusterProfiler等數據包對膽舒膠囊治療靶點的生物進程、分子功能、細胞成分3個水平進行GO富集分析；同樣方法進行KEGG富集分析，R語言繪制KEGG信號通路富集分析高級氣泡圖，以揭示膽舒膠囊治療慢性膽囊炎的分子機制。

3 結果

3.1 藥物靶點及疾病靶點的確定TSMCP平臺檢索得到薄荷化學成分有164個，符合篩選條件的化學成分10個，分別為金柑苷、金合歡素、蒙花苷、豆甾醇、谷甾醇、柚皮素、蘆薈大黃素、圣草酚、芫花素、木犀草素；結合文獻報道薄荷揮發油含量高的4個活性成分，分別是L-薄荷酮、胡椒酮、L-薄荷醇、胡薄荷酮；在Swiss target predict數據庫剔除未獲得成分對應靶點的蘆薈大黃素以及未與疾病靶點獲得交集的胡薄荷酮，篩選出薄荷化學成分12個，薄荷作用靶點270個，見表1。經過GeneCards與OMIM數據庫檢索，整合獲得慢性膽囊炎疾病靶點502個，運用Venny 2.1.0軟件取薄荷與慢性膽囊炎疾病靶點交集，見圖1。得到治療靶點36個，見表2。

表1 薄荷關鍵化合物

圖1 韋恩圖

表2 薄荷治療慢性膽囊炎的關鍵靶點

3.2 PPI網絡將治療靶點上傳String數據庫，物種設置為“智人”，選擇medium confidence(0.400)，隱藏離散點，得到靶點相互作用網絡圖，見圖2。其中節點代表治療靶點，“邊”代表治療靶點之間的關聯，其粗細用結合分數表示，“邊”越粗結合分數值越大，代表其結合度越大。由R語言軟件繪制出節點數排名前20的核心基因條形圖，橫坐標為節點數，縱坐標為基因symbol。見圖3。

圖2 薄荷靶點蛋白相互作用網絡圖

圖3 蛋白互作核心基因柱狀圖

3.3 “薄荷-有效活性成分-交集治療靶點-疾病”網絡圖應用Cytoscape軟件構建薄荷治療慢性膽囊炎的藥物-有效活性成分-交集治療靶點-疾病相互作用網絡圖，從而間接體現了膽舒膠囊治療慢性膽囊炎多組分、多靶點協同作用的特點。見圖4。

圖4 薄荷-有效活性成分-交集治療靶點-疾病相互作用網絡圖

3.4 GO富集分析采用UniProt數據庫對基因symbol進行ID轉換，依托Bioconductor數據庫，運用R語言軟件及clusterProfiler等數據包，設置pvalueCutoff與qvalueCutoff的值為0.05，從生物進程、分子功能、細胞成分3個水平對36個關鍵靶點進行分類富集分析，GO富集結果包括細胞對氧化的應激反應、對金屬離子的響應、正向調節平滑肌細胞的增殖、膠原代謝過程等生物進程；蛋白磷酸酶、絲氨酸水解酶活性、過氧化酶活性等分子功能；膜筏、膜微結構域、肥大細胞顆粒等細胞成分。

3.5 KEGG富集分析利用上述的基因ID，同樣依托Bioconductor數據庫，利用R語言軟件及clusterProfiler等數據包，設置pvalueCutoff與qvalueCutoff的值為0.05進行KEGG信號通路分析，包括癌癥通路、TNF信號通路、Relaxin信號通路、磷酸酯酶D信號通路、VGEF信號通路、缺氧誘導因子1信號通路等代謝通路。取排名前20的KEGG信號通路繪制高級氣泡圖。見圖6。

圖6 KEGG通路富集分析高級氣泡圖

4 討論

網絡藥理學對藥物治療疾病的靶點、通路等可以從分子水平上預測，故本文通過該策略研討膽舒膠囊醫治慢性膽囊炎的分子機制，結果獲得12個主要活性成分，分別為金柑苷、金合歡素、蒙花苷、豆甾醇、谷甾醇、柚皮素、圣草酚、芫花素、木犀草素、L-薄荷酮、L-薄荷醇、胡椒酮。現階段發現金合歡素具備多重生物活性，如抑菌、抗炎、抗癌、抗氧化、免疫調節等效用[4]。蒙花苷可以通過調節炎性因子與炎性介質的水平而產生抗炎鎮痛作用[5]。谷甾醇的抗炎機制可能是通過抑制炎癥介質PGE2、緩激肽、組胺、5-HT等的活性來抑制游離細胞的遷移[6]。豆甾醇和圣草酚具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎癥等藥理活性。L-薄荷酮、L-薄荷醇、胡椒酮為薄荷揮發油中含量高的主要成分，它們可通過干預消化道鈣離子的跨膜運動產生解痙、使消化道平滑肌松弛，形成利膽作用[7]。周露[8]的研究表明薄荷揮發油具有顯著的抗大腸埃希氏菌、嗜肉菌、白假絲酵母菌等菌株活性。

藥物與疾病的交集靶點36個，包括VEGFA、AKT1、EGFR、TNF、MAPK3、PTGS2、MMP9、MMP2、MPO、HIF1A等，主要涉及血管生成、炎癥反應、癌癥進展、細胞凋亡及氧化應激等生理病理進程。在VEGFRA-VEGFR2信號蛋白通路中，PI3K下游信號的AKT激活后，通過下游的Bad、mTORC1、FOXO、GSK-3β、eNOS等靶分子調節細胞凋亡和血管通透性、參與血管生成和浸潤轉移相關的炎癥反應。表皮生長因子受體(EGFR)是影響局部上皮組織新生血管修復和內皮細胞形成的重要因素，其可以參與癌癥、炎癥、免疫疾病的進展。EGFR是EGF與TGF-α受體；同時，相關研究表明，EGFR可導致膽固醇核化過程異常，促使膽結石的形成[9]。因此，我們推測，薄荷中的有效活性成分可與EGFR相互作用，阻斷促炎因子與EGFR結合，起到抗炎作用，同時抑制膽結石的形成。腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor, TNF)是一類可誘導細胞凋亡的因子，可由多種細胞分泌表達，其生物學功能主要包括細胞凋亡、誘導炎癥反應和免疫調節等。TNF-α細胞因子處于家族中最重要的地位，主要通過對MAPK、NF-κB、ERK等信號通路的上調，起誘導細胞凋亡和促炎作用[10]。MAPK靶點同樣與腫瘤、炎癥、氧化應激密切相關[11]，磷酸化的p38MAPK可激活許多底物如轉錄因子、胞漿與胞核內蛋白、蛋白激酶等，誘導炎癥反應、細胞的分化、周期停滯、衰老、凋亡、細胞因子的產生和RNA剪接的調控等，且這種活化作用通常具有組織細胞特異性。前列腺素內過氧化物合酶(PTGS2)作為環氧酶途徑中的雙功能酶，作為前列腺素中氧化酶的還原酶，具備COX與過氧化酶活性，可將花生四烯酸催化成前列腺素，推測薄荷活性成分可能通過抑制PTGS2以達到抗炎、鎮痛效果。MMPs是肽鏈內切酶，它能夠降解細胞外基(ECM)的組成成分，MMP9、MMP2可促成腫瘤新生血管的形成，導致血管局部基底膜降解，創造促進血管生成，促進腫瘤細胞侵襲轉移的微環境[12]。髓系細胞中的髓過氧化物酶(MPO)遇到病原體后，骨髓細胞可以產生過量的H2O2，MPO與H2O2等氧化劑發生過氧化反應和正鹵化反應，產生殺菌能力很強的次氯酸(HClO)，可引起蛋白質破裂、DNA變性和氨基酸分解等病理過程[13]。缺氧誘導因子1(HIF-1)作為一種由機體在缺氧時產生的依賴氧的轉錄激活物,誘導VEGF、促炎黏附分子和趨化因子的表達，調節機體適應缺氧環境。

經過GO及KEGG富集結果分析可知，GO富集分析發現關鍵靶點參與細胞的氧化應激反應、金屬離子的響應、正向調節平滑肌細胞的增殖、膠原代謝過程等生物進程；蛋白磷酸酶、絲氨酸水解酶活性、過氧化酶活性等分子功能；膜筏、膜微結構域、肥大細胞顆粒等細胞成分。KEGG富集分析提示膽舒膠囊主要是通過癌癥、TNF、Relaxin、磷酸酯酶D、VEGF、HIF-1等信號通路發揮協同作用。HIF-1通路水平的變化與AKT，NF-κB通路有關，還可誘導VEGF的轉錄，為干預炎癥損傷、氧化應激、凋亡、腫瘤的重要信號通路[14]。薄荷活性成分可通過Relaxin信號通路發揮抗炎作用：relaxin-2可以抑制 TNF-α誘導的單核細胞對血管內皮細胞的粘附[15]。

綜上所述，本文初次運用網絡藥理學的策略研究膽舒膠囊醫治慢性膽囊炎分子機制，提示其可能通過抗炎鎮痛、解痙、利膽、抗菌等方面來治療慢性膽囊炎；成功地預測了膽舒膠囊治療慢性膽囊炎主要作用的靶點與相關的信號通路，發現膽舒膠囊經過多組分-多靶點-多通路發揮醫治作用，為后續的實驗研究等提供參考。