枸櫞酸鈉對高磷誘導小鼠血管平滑肌細胞鈣化的抑制作用及機制

陳輝 余輝

咸寧市中心醫院湖北科技學院附屬第一醫院 437000

目前，雖然維持性血液透析能顯著提高慢性腎臟病（CKD）患者的長期生存率和生活質量，但血液透析的遠期并發癥尤其是心血管疾病（CVD）仍是威脅患者生命和影響其預后的重要因素［1］。研究表明，40%～70%透析患者存在明顯的冠狀動脈疾病，而其中血管鈣化（vascular calcification，VC）是導致血液透析患者CVD 發生及死亡的主要原因［2］。

CKD患者VC的發生并非簡單的鈣磷被動沉積，而是一個包含平滑肌細胞（VSMCs）凋亡，向成骨樣細胞表型轉換的類似骨形成的生理過程。細胞外的鈣和磷酸鹽濃度增加后，會導致VSMCs由收縮型過渡到骨軟骨細胞表型，形成一個親鈣化基質，并釋放大量的基質囊泡，從而為羥基磷灰石形成提供結核位點。這個過程中鈣化抑制因子［如基質Gla蛋白（MGP）、焦磷酸鹽（PPi）、胎球蛋白A（Fetuin-A）等］表達下調，而鈣化促進因子［如堿性磷酸酶（ALP）、骨形態發生蛋白2（BMP-2）、核結合因子α 亞單位1（Cbfa1）等］表達上調［3］。

枸櫞酸鈉（Na3Cit）是血液透析過程中常用的抗凝劑，K?se 等［4］的體內研究發現透析患者注射枸櫞酸鈉（Na3Cit）一段時間后，心臟瓣膜的鈣化明顯減輕，瓣膜組織內的鈣磷水平發生降低，鈣化周圍的膠原纖維也明顯減少。Ou 等［5］研究發現Na3Cit 能夠減輕患有慢性腎功能衰竭的大鼠的VC，而Meng 等［6］發現作為抗凝劑的肝素對CKD 大鼠的VC的進程沒有影響。Na3Cit 中的羧基也能通過螯合羥基磷灰石（HAp）表面的鈣離子，從而阻止HAp 進一步生長并減小晶體的厚度。雖然上述大量的研究表明Na3Cit 能夠抑制VC，但其具體的抑制機制尚不清楚。

本文使用3 mmol/L 的高磷（Pi）（相當于晚期CKD 患者血清磷的濃度）誘導小鼠主動脈血管平滑肌細胞（MOVAS）鈣化，同時加入不同濃度的Na3Cit 來研究其抗VC 效果及可能的機制，期望為降低血液透析患者后期VC發病率及治療提供新的啟示，并尋找既能抗凝又能抗VC的藥物。

1 試驗部分

1.1 試劑與儀器（1）材料：原代小鼠主動脈血管平滑肌細胞（MOVAS）購自廣州吉賽生物科技股份有限公司，DMEM 培養液［Hyclone，海克隆生物化學制品（北京）有限公司］，胎牛血清和胰酶（Gibco，美國Gibco 公司），青霉素、鏈霉素（北京普博生物技術有限公司），細胞增殖毒性檢測試劑盒（Cell Counting Kit-8，CCK-8）（日本同仁化學研究所），茜素紅染液、BCA 蛋白定量試劑盒、堿性磷酸酶試劑盒、堿性磷酸酶染色試劑盒、Na3Cit 均購自上海碧云天生物技術有限公司，鈣測定試劑盒購自北京中生北控生物科技股份有限公司，Trizol 試劑盒（Invitrogen 公司），Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡雙染試劑盒（美國BD 公司）；其他化學試劑均為分析純并購自廣州化學試劑公司。細胞培養板［NEST，耐思生物科技（無錫）有限公司］。（2）儀器：酶標儀（Thermo Multiskan MK3，美國），倒置熒光顯微鏡（Leica DMRA2，德國），光學顯微鏡（CKX41，OLYMPUS，日本），流式細胞儀（FACS Aria，BD，美國），熒光定量PCR 儀（ABI7500型，美國ABI公司）。

1.2 細胞培養 原代MOVAS 細胞用含10%胎牛血清的DMEM 培養液在37℃、5%CO2和飽和濕度下培養。細胞傳代采用胰蛋白酶消化法。當細胞達80%～90%融合后用PBS 緩沖液洗滌兩次，加入0.25%胰酶-EDTA 消化液，置37℃培養箱3～5 min，在倒置顯微鏡下觀察消化程度，消化適度后，加入10%胎牛血清的DMEM培養液終止消化，充分吹打分散細胞，形成單細胞懸液。

1.3 細胞活力檢測 把1.2 中制得的單細胞懸液按濃度為5.0×104cells/ml、100 μl/孔接種于96 孔培養板中孵育24 h 后，改用無血清的DMEM 培養液孵育12 h，使細胞同步化。吸除培養液，用PBS 洗滌細胞兩次。將試驗模型分為2 組：（A）對照組，只加入無血清培養液；（B）Na3Cit 處理組，分別加入濃度為0.5、1、2、4、8、10、16 mmol/L（用無血清培養液配制）的Na3Cit。每個濃度設6 個復孔，同時設細胞對照（抑制劑濃度為0），每孔補加100 μl 細胞培養液，孵育24 h后，每孔加入10 μl 的CCK-8 試劑，避光孵育1.5 h。用酶標儀在450 nm 處測量吸光度（A），求得3 個復孔A 值的平均值。細胞活力%＝A（試驗組）/A（對照組）×100%。

1.4 茜素紅鈣化染色 原代MOVAS 按濃度為1.5×104cells/well接種于24孔培養板；吸除培養液，用PBS洗滌細胞兩次。試驗模型分為4 組：（A）正常對照組：加入含1%FBS的DMEM 培養液（0.9 mmol/L Pi）；（B）高磷誘導組：加入含1% FBS 和3 mmol/L Pi 的DMEM 培養液；（C）低濃度Na3Cit處理組：分別加入含1 mmol/L Na3Cit的1%FBS，3 mmol/L Pi DMEM 培養液；（D）高濃度Na3Cit 處理組：分別加入含4 mmol/L Na3Cit 的1%FBS，3 mmol/L Pi DMEM 培養液。各組細胞每隔兩天換一次液，孵育14 d。孵育14 d 后棄去上清，用PBS 沖洗3 遍，4%多聚甲醛室溫固定20～30 min，再用PBS 沖洗2 遍，茜素紅染色，37℃溫箱中孵育30 min，吸去茜素紅染料，再用PBS沖洗2遍，最后用倒置顯微鏡下觀察。

1.5 細胞鈣沉積定量檢測 采用鄰甲酚酞絡合酮法檢測細胞鈣沉積量。其原理是鈣與鄰甲酚酞絡合酮在pH為10～12 時形成紅色復合物，在575 nm 紫外光處產生最大吸收值，光的吸收值與鈣含量成正比。細胞種板密度和試驗分組參照1.4 進行。培養14 d 后將培養的細胞棄去培養液，PBS液沖洗細胞3次，每孔板內加入0.6 mol/L鹽酸，放置在室溫下脫鈣24 h，吸取上清液參照說明書進行鈣離子含量測定。細胞脫鈣后，加入細胞裂解液裂解細胞，參照BCA蛋白定量試劑盒的方法檢測蛋白的含量。通過蛋白含量來標化鈣沉積含量。

1.6 實時熒光定量PCR 檢測平滑肌特異性基因表達細胞種板密度和試驗分組參照1.4 進行。培養14 d 后棄去培養液，PBS液沖洗細胞3次，采用Trizol試劑并按照試劑盒的方法提取總RNA，然后用上標III 逆轉錄試劑參照試劑盒方法反轉錄為cDNA。SM22-α引物序列由武漢金開瑞生物工程有限公司設計并合成，同時參照Liao 等［7］的方法檢測和計算SM22-α mRNA表達情況。

1.7 堿性磷酸酶（ALP）活性檢測 細胞種板密度和試驗分組參照1.4 進行。培養14 d 后將培養的細胞棄去培養液，PBS 液沖洗細胞3 次，每孔加入500 μl 0.1% Triton X-100（用PBS 配制），4℃過夜，反復吹打使細胞破碎，收集在離心管中，1 200 rpm 離心3 min，收集上清，ALP 活性通過對硝基苯酚及堿性磷酸酶檢測試劑盒來測定，并用總蛋白來修正［7］，每組試驗重復3次，取平均值。

1.8 ALP活性定性觀察 細胞種板密度和試驗分組參照1.4進行。孵育14 d后棄去上清，用PBS沖洗3遍，參照堿性磷酸酶染色試劑盒方法加入染料，室溫孵育30 min，再用PBS沖洗2遍，最后用倒置顯微鏡下觀察。

1.9 細胞凋亡檢測 細胞種板以1×105cells/ml、2 ml/孔接種于6 孔板，試驗分組參照1.4 進行。細胞培養14 d 后吸除上清液，PBS 洗滌2 次，用0.25%胰酶消化，消化適度后加入10%胎牛血清的DMEM 培養液終止消化。吹打細胞，使細胞懸浮，然后1 000 r/min 離心5 min，棄上清，用PBS 洗滌一次，重新離心，得到細胞沉淀。加入200 μl Binding Buffer，混勻，再加入5 μl Annexin V-FITC，室溫避光孵育10 min。離心，去上清。加入200 μl Binding Buffer，混勻，再加入5 μl PI，直接上機檢測。

2 試驗結果

2.1 Na3Cit 對細胞活力的影響 圖1 為采用CCK-8 法檢測的不同濃度Na3Cit 與MOVAS 細胞作用24 h 后的細胞活力變化。可以看出，Na3Cit對MOVAS具有一定的毒性，且毒性存在濃度效應。隨著抑制劑濃度從0.5 mmol/L 逐漸增加到16 mmol/L，Na3Cit 引起的細胞的活力從98.4%減少至43.5%。由于濃度大于4 mmol/L 時，Na3Cit 對細胞有較大的毒性，因此本文后期試驗選擇抑制劑濃度1～4 mmol/L 作為研究對象，在此濃度范圍內，抑制劑自身毒性帶來的影響相對較小，可以反映出Na3Cit 在濃度差異較大時抗VC 的效果。

2.2 Na3Cit 抑制高磷誘導的MOVAS 鈣化 茜素紅能與鈣鹽螯合形成橘紅色的鈣沉積物。圖2 為高磷條件下，不同濃度Na3Cit 與MOVAS 孵育14 d 后茜素紅鈣化染色結果。可以看出：（1）對照組細胞無明顯的鈣沉積出現（圖2A），而高磷誘導組（圖2B）出現大量的鈣沉積；（2）與高磷誘導組相比，加入不同濃度Na3Cit后，MOVAS鈣化斑塊明顯減少（圖2C 和2D），說明Na3Cit 能抑制VC，并且其抑制效果隨著濃度的增加而更加明顯。

圖1 不同濃度Na3Cit與MOVAS作用24 h后的細胞活力變化

圖2 MOVAS在高磷及不同濃度Na3Cit條件下作用14 d后經茜素紅染色后倒置顯微鏡下觀察的細胞鈣化情況（200×）

2.3 定量檢測Na3Cit 抑制鈣化效果 圖3 為采用甲酚酞絡合酮法來檢測不同濃度Na3Cit 與細胞作用14 d 后的細胞鈣沉積量。與高磷誘導組相比，加入Na3Cit 的處理組中細胞鈣沉積量均有不同濃度的降低，表明它們均能抑制平滑肌細胞鈣化，且高濃度的Na3Cit 抑制效果更好，這與茜素紅染色觀察的結果（圖2）一致。

圖3 MOVAS在高磷及不同濃度Na3Cit作用14 d后的鈣沉積量

2.4 Na3Cit對SM22-α表達的影響 SM22-α作為收縮型VSMCs 的標示物，在VSMCs 向成骨樣細胞表型轉化過程中其表達下調［7］。如圖4 所示，與正常組細胞相比，高磷誘導組細胞中SM22-α mRNA 表達明顯下調。而不同濃度Na3Cit 處理組中SM22-α mRNA 表達明顯高于高磷誘導組，說明Na3Cit 能夠通過抑制平滑肌細胞向成骨樣細胞轉化來抗鈣化。且隨著濃度增加，SM22-α mRNA 表達更強，表明在高磷條件下Na3Cit抑制VSMCs 向成骨樣細胞轉化具有濃度依賴性。

2.5 Na3Cit抑制ALP的活性 如圖5所示，不同濃度的Na3Cit 處理組細胞中ALP 的含量均比高磷誘導組小，表明Na3Cit 能通過抑制平滑肌細胞向成骨樣細胞表型轉化從而抑制鈣化，且這種抑制作用具有濃度依賴性。

圖4 MOVAS在高磷及不同濃度Na3Cit作用14 d后細胞內SM22-α mRNA表達情況

圖5 MOVAS在高磷及不同濃度Na3Cit作用14 d后細胞內ALP的活性

2.6 定性觀察ALP 活性 為了進一步觀察了ALP 在細胞內的表達來觀察細胞表型，采用ALP 染色試劑盒對細胞進行染色，其結果如圖6 所示。結果表明，不同濃度的Na3Cit呈濃度依賴性方式來抑制高磷誘導的ALP的表達，從而抑制平滑肌細胞向成骨樣細胞表型轉化。這一結果與圖5相一致。

2.7 Na3Cit抑制高磷誘導的MOVAS凋亡 圖7為不同濃度的Na3Cit 與MOVAS 孵育14 d 后通過Annexin V 法檢測的細胞總凋亡率（Q2+Q3）結果。高磷誘導組（Pi）細胞的凋亡率（16.39%）明顯高于對照組（6.33%）（圖7B）。與高磷誘導組相比，Na3Cit 處理組濃度從1 mmol/L 增加到4 mmol/L，細胞凋亡率從12.73%減小10.08%，表明Na3Cit 能通過抑制細胞凋亡來抑制鈣化，且抑制效果具有濃度依賴性。

3 討論

3.1 Na3Cit 通過抑制鈣磷的沉積從而抑制鈣化 鈣化過程中凋亡小體釋放的Ca2+離子和離子均聚集在基質小泡膜內或接近膜處。一旦鈣離子和磷酸鹽積累至足夠量，首先形成非晶體的無定形磷酸鈣，再轉變為磷酸八鈣，最后形成高度難溶的羥基磷灰石（HAp）。之后，HAp 通過相同方式重復成核、結晶，并擴大沉積區域［6］。圖2 和圖3 結果表明，不同濃度的Na3Cit 均能抑制高磷誘導的MOVAS 鈣化，并且高濃度的Na3Cit 抑制效果更好。大量研究表明鈣化患者服用螯合劑乙二胺四乙酸（EDTA）、枸櫞酸和N，N，N，N-四-（2-吡啶基甲基）-乙二胺（TPEN）后，其動脈粥樣硬化斑塊明顯減少［8］。并且Hu等［9］體外實驗表明富含羧基的蛋白質如骨鈣素和骨橋蛋白能夠抑制羥基磷灰石晶體的形成和生長。因此我們推測Na3Cit 能夠直接抑制HAp 的形成從而抑制VC，這與Villa-Bellosta 和Sorribas［10］的研究結果相一致。ALP 是成骨樣細胞形成的早期標志物。VC 過程中，ALP 被分泌到細胞外基質中，形成局部高濃度的ALP，促使磷酸鹽升高，形成不可溶解的磷酸鹽結晶，導致礦化形成。ALP在正常VSMCs中的濃度較低，在鈣化的血管和心臟瓣膜組織中的濃度明顯增高。

3.2 Na3Cit能通過抑制VSMCs向成骨樣表型轉化抑制VC VSMCs 向成骨樣細胞轉化在VC 過程中起著關鍵的作用。正常血磷條件下，VSMCs表達為收縮型平滑肌細胞，其標志物SM22-α 等表達較多［11］。高磷條件下，VSMCs 向成骨細胞表型轉換，成骨特異性轉錄因子（如Cbfa1、ALP、SOX9 以及MSX2 等）表達上調，而VSMCs 收縮特異性基因（如SM-MHC、SM22-α 和α-SMA 等）表達下調［12］。ALP 是成骨細胞的一個功能性表型標記物，其活性經常被視為血管鈣化的晴雨表。上調的ALP 可降解VC 的抑制因子（如PPi），從而促進鈣化的發展［13］。Liu 等［14］和Zavaczki 等［15］發現抑制VSMCs 向成骨細胞表型轉化能減輕VC。我們發現不同濃度的Na3Cit 均能在高磷條件下抑制ALP 的活性（圖5），并上調SM22-α的表達（圖4），說明Na3Cit能抑制VSMCs向成骨樣細胞表型轉化來抗VC，但其具體的信號通路還需要進一步研究。

3.3 Na3Cit 能通過抑制MOVAS 凋亡抑制VC 細胞凋亡出現在VC的起始階段，并在鈣化過程中也起著重要的作用［16］。高磷能促進VSMCs 凋亡以及釋放具有礦化能力的基質囊泡（MV），而MV 能下調鈣化抑制因子如基質蛋白（MGP）的表達，活化基質金屬蛋白酶2（MMP-2），加速彈力蛋白降解，進而促使鈣化的形成［17］。并且MV 與細胞凋亡產生的凋亡小體一同為鈣磷結晶在主動脈上的沉積及向HAP 的轉化提供成核位點，而且凋亡小體還富含Ca2+和，凋亡性細胞死亡后比原來釋放更多的鈣，這反過來又可以驅動進一步凋亡，從而加速鈣化的進程［18］。而抑制細胞凋亡能夠明顯抑制VC［19］。圖4 結果表明，不同濃度的Na3Cit 均可以明顯減少高磷誘導MOVSA 的凋亡，并且高濃度的Na3Cit抑制效果更好，這一結果與Ciceri 等［20］的研究相一致。

圖6 MOVAS在高磷及不同濃度Na3Cit作用14 d后細胞內ALP表達情況（400×）

圖7 MOVAS在高磷及不同濃度Na3Cit作用14 d后經Annexin V法定量檢測細胞的凋亡率（A）；細胞凋亡率（Q2+Q3）柱狀圖（B）

不同濃度的Na3Cit 均能減少高磷誘導的MOVAS 細胞的鈣化，且高濃度的Na3Cit抑制效果更好。Na3Cit主要通過抑制鈣磷沉積、減小高磷條件下細胞凋亡以及抑制平滑肌細胞向成骨樣細胞表型轉化來抑制鈣化。作為血液抗凝劑的Na3Cit 有可能在臨床中同時發揮抗VC 的作用，從而為CKD 患者VC 的防治提供理論基礎。由于體外鈣化模型與CKD 患者體內鈣化有很大的差異［21］，因此Na3Cit 抗鈣化的具體機制還需進一步深入探討。

利益沖突：作者已申明文章無相關利益沖突。