紫甘藍色素的提取純化及性質分析

＊呂楚瀅 劉軍民

（中山大學材料科學與工程學院 廣東 510275）

1.背景

色素通常分為天然色素和合成色素，其中花青素是最為人所知的一類色素，而紫甘藍色素是花青素中的一員。紫甘藍為十字花科蕓薹屬，原產于歐洲地中海沿岸至北海沿岸地區，現如今在我國已廣泛種植。紫甘藍色素通常是指以花青素與糖苷結合的形式存在的花色苷結構[1]。紫甘藍色素具有天然無毒，色彩鮮艷以及抗氧化的優點，可應用于衣物染色[2]、食品添加劑[3]和腫瘤治療[4]等方面。

(1)天然色素

天然色素是指從天然原料（一般為植物）中提取出來的色素，可分為三類。第一類是類黃酮類色素，基本結構為2-苯基苯并吡喃酮，具有清除氧自由基的功能，所以常用于藥物。本實驗研究的花色苷就是一種類黃酮類色素。第二類是醌類色素，具有很強的鰲合性，故要避免和金屬離子接觸。第三類是類胡蘿卜素類色素，通常為共軛烯烴結構，是一種脂溶性色素，對光、熱和金屬過氧化物敏感。

(2)花色苷結構

圖1 花色苷的結構

花色苷（Anthocyanin）是指花色素與糖分子通過糖苷鍵結合而成的化合物（圖1），花色素的結構為2-苯基苯并吡喃型陽離子，其基本骨架為C6-C3-C6。2-苯基苯并吡喃型陽離子結構通常被稱為母核，母核上的羥基和甲氧基的數量不同造就了花青素種類的不同，常見的有六種：矢車菊色素、芍藥色素、天竺葵色素、飛燕草色素、牽牛花色素以及錦葵色素（表1）[5]。

表1 種類繁多的花色苷[5]

(3)花色苷的提取

花色苷類的色素主要存在于植物體中的花、葉和果實等部位，其中含有的酚類化合物是具有抗氧化作用的活性物質，可以入藥，提取的目的是要提出其中的多酚類物質。花色苷在pH值較小的條件下穩定存在，因此大多數花色苷提取的方法都在酸性溶液中進行。

①溶劑提取法。花色苷結構中含有若干個羥基和甲氧基，是一種極性化合物。根據溶液的相似相溶原理，花色苷常用極性溶液溶解。常規的溶劑是水和甲醇、乙醇或者丙酮等極性溶劑的混合物。用于食物時，出于安全考慮，也用檸檬酸、酒石酸等酸性溫和的酸作提取液。因為樣品中常常含有多種抗氧化物質，所以沒有一種溶劑可以同時將樣品中的所有有機物都提取出來，一般都需要多種溶劑混用。

②超聲波輔助提取法。超聲波是指頻率高于2×104Hz的聲波，具有能量集中的特點。它可以使花青素溶液中產生氣泡，在持續的聲波作用下氣泡會爆炸性破裂，產生局部壓力，使植物細胞破裂。

③微波提取法。微波是指頻率在300MHz-300GHz的電磁波。微波的加熱方式是體加熱，不同于常規加熱。常規的加熱方式是通過熱輻射由表及里進行傳導式加熱，能量利用效率低且溫度分布不勻。而微波加熱是將吸收的電磁能轉變成為熱能，升溫快并且里外溫度相差不大。在2011年，Liazid等人[6]在100℃和磁力攪拌下，25mL的40%的甲醇水溶劑中，選擇500W的功率，實現了在5min內從葡萄皮中提取了花色苷，且重復性良好。由于微波提取具有能量效率高、可重復性和選擇性優越的特點，本實驗采用微波提取的方法。

(4)花色苷的純化

經過初步提取的色素水溶液中除了有我們所需要的多酚類物質，還有許多的糖、酸等大分子雜質，需要對粗提取液進一步純化。

①膜分離法。膜分離法是利用各種天然或人工制造的具有選擇透過性的膜，如超濾膜、滲透膜和反滲透膜等，對粗提取液進行過濾，具有節能、分離效率高和產品質量高的優點。但由于該方法對設備要求較高，成本昂貴，不適用于工業應用。②重結晶法。使用醋酸鉛使色素沉淀，過濾，酸洗，再過濾，得到純度較高的花色苷溶液。但由于醋酸鉛有毒，該法不適用于食用色素的提純。③柱層析法。柱層析法通常選擇氧化鋁和硅膠作吸附劑。吸附劑將混合物中的各組分從溶液中吸附到其表面上，然后再用溶劑洗脫。由于各組分被吸附的程度不同，吸附強的組分移動慢，后洗出，吸附弱的組分移動快，先洗出，從而達到分離的目的。出于成本和可操作性的考慮，本實驗采用的是最常用的柱層析法。

本文選取紫甘藍為研究對象，通過微波萃取和柱層析法提取和純化天然的紫甘藍色素，并探究不同酸度和金屬離子對其穩定性的影響，為花色苷的工業生產提供依據。

2.實驗部分

(1)實驗試劑

濃鹽酸（Hydrochloric Acid,HCl），丙酮（Acetone），正丁醇（n-butanol），硫酸鋁（Aluminium Sulpate），氯化鉀（Potassium Chloride），氯化鎂（Magnesium Chloride），氯化鎳（II）六水（Nickel（II）Chloride Hexahydrate），醋酸鉛（Lead Acetate），乙酸銅（Cupric Acetate Monohydrate），硅膠（Silica Gel），均為分析純，購于廣州化學試劑廠，使用時根據需要進行干燥純化操作或直接使用。

(2)實驗儀器

MCR-3微波化學反應器：采用非脈沖微波連續加熱，設定功率檔位為7檔，輻射溫度60℃和輻射時間為180s；旋轉蒸發儀：采用Heidolph Hei-VAP Value Digital型號；上海元析牌紫外可見光度計：采用掃描型UV-6000PC型號；真空干燥箱、酸度計。以上試劑與儀器均由中山大學東校區實驗教學中心提供。

(3)紫甘藍色素的提取和純化

①洗凈晾干切碎紫甘藍并準確稱取1 0 g（實際為10.1825g），置于1個錐形瓶中。加入50mL的0.35mol/L鹽酸，微波輻射3min，趁熱過濾，得到色素粗提取液。色素粗提液旋蒸至約5mL時取出，用于柱層析中的濕法上樣。②用硅膠作為吸附劑，濕法裝柱，濕法上樣，柱層析進行純化，流動相為正丁醇:丙酮:水:鹽酸=6:1:1:2。收集紅色洗脫液，經過旋轉蒸發儀蒸發旋干，并真空干燥得到紅色粉末，稱重為0.4126g，提純率為4.05%。③取適量色素膠質，在50mL容量瓶中配為色素水溶液，利用紫外可見分光光譜儀進行吸收光譜掃描，控制其吸光度范圍在0.1-1.0之間。

(4)探究不同酸度對紫甘藍天然色素的影響

①在50mL容量瓶中，配置0.1mol/L鹽酸溶液和0.1mol/L氫氧化鈉水溶液。②用0.1mol/L鹽酸溶液，0.1mol/L氫氧化鈉水溶液，以及蒸餾水，按不同體積比配制pH為3，5，7，9，11的溶液，分別取3mL不同酸度的溶液，放置于5個干凈的試管中。③在以上試管中，分別逐滴加入2mL的色素溶液，放置10min，發現不同樣品呈現出不同程度的粉色，然后測吸光度。

(5)探究金屬離子對紫甘藍天然色素的影響

①在6個干凈試管中分別加入配好的4mL色素水溶液。②在6個含4mL色素水溶液的試管中，分別逐滴加入1mL配好的0.1mol/L的K+、Cu2+、Mg2+、Al3+、Ni2+及Pb2+離子溶液。③放置10min，發現不同樣品呈現不同的顏色，然后測吸光度。

3.結果與分析

(1)不同酸度對色素性質的影響

圖2 不同酸度的色素溶液的紫外可見光譜曲線

圖3 不同pH值下花色苷結構的變化[5]

表2 不同酸度的紫甘藍色素溶液的吸光度

因為空白組用的是5mL的原色素溶液，其最大的Abs值為0.363（見圖2中的黑色線），而實驗組均為2mL原色素溶液和3mL不同pH值的水溶液的混合液，所以經朗伯-比爾定律A=Kcl公式（其中K為摩爾吸光系數，c為吸光物質的濃度，l為吸收介質的厚度）校正得，2mL的原色素溶液稀釋成5mL溶液后，其最大的Abs值應為0.145。

隨pH增大，溶液的顏色從粉紅變成淡粉，顏色逐漸變淺。在pH值為3-5的范圍內，色素溶液的最大吸收波長幾乎不變，但吸光度逐漸減小；當pH值提高到7時，吸光度有一個小幅度的提高；而pH為9-11時，吸收波長紅移，吸光度繼續減小（圖2和表2）。

這是因為花色苷具有一種受酸堿條件影響較大的結構。在不同的pH條件下，花色苷有四種不同的結構形式（圖3）：淺紫色的醌型堿（Quinoidal Base，A）、紅色的黃烊鹽離子（Flavylium，AH+）、無色的甲醇假堿（Carbinol Pseudobase，B）、無色的查耳酮（Chalcone，C）。當溶液的pH值較小時，花青素以紅色的黃烊鹽陽離子（AH+）的形式存在，當pH值增大時，水分子親核攻擊AH+的2位，破壞其雙鍵，生成的無色甲醇假堿B，吸光度下降。當pH值繼續增大到7-9范圍時，B會脫去質子形成藍色的醌型堿，吸光度增大。當pH值大于9后，隨pH值增大，醌型堿會開環變成查耳酮C，吸光度會降低。

(2)不同金屬離子對色素性質的影響

空白組用的是5mL的原色素溶液，其最大的Abs值為0.363（見圖4中的黑色線），而實驗組均為4mL原色素溶液和1mL不同金屬離子的水溶液的混合液，所以經朗伯-比爾定律校正得，4mL的原色素溶液稀釋成5mL溶液后，其最大的Abs值應為0.290。

隨著K+、Mg2+水溶液的加入，溶液的最大吸收波長幾乎沒變，都保持在525nm左右，顏色為粉紅色。隨著Ni2+的溶液的加入，溶液的最大吸收波仍在525nm左右，但是吸光度有所下降，為淺粉色。加入Al3+離子溶液之后溶液顏色變成了深紫色，最大吸收波長紅移至565nm，吸光度急劇增大。加入Pb2+離子溶液后，顏色為綠色，最大吸收波長紅移至600nm，吸光度上升。而加入Cu2+后溶液顏色變成淺綠，吸收波長也紅移至600nm，吸光度降低（圖5和表3）。

圖4 加入不同金屬離子溶液的色素溶液的紫外光譜曲線

圖5 加入不同金屬離子水溶液后的色素水溶液

表3 加入不同金屬離子溶液的色素溶液的吸光度

分析原因可知，花色苷分子含酚羥基和γ-吡喃酮環，容易與金屬離子發生絡合反應，形成紫甘藍-金屬離子絡合物，可吸收紫外或可見光區的某一部分波長而發生電荷轉移躍遷，電子從酚氧基配體的π軌道躍遷到金屬離子的某一軌道，使紫甘藍在紫外-可見區域吸收發生改變。K+和Mg2+可能沒有與花色苷發生絡合反應，查閱文獻可知，Mg2+對花色苷有穩定作用，在植物體中大量存在[7]。而Ni2+和Cu2+離子，其價電子層結構分別為3d8和3d9，（n-1）d軌道未填滿，可與花色苷配位，形成內軌配合物，發生配位電荷轉移，表現為顏色變淺。因Cu2+離子溶液本身是藍色，加入色素溶液后變成淺綠色。Al3+和Pb2+離子最外層的s、p和d軌道都是空軌道，可與花色苷配位得到外軌配合物，電子由花色苷躍遷至金屬離子的空軌道時，波長紅移，吸光度增加，溶液顏色變深，其中以Al3+的增色效應最明顯。

4.結語

本實驗提取并純化了紫甘藍色素以及測試了不同酸度和金屬離子對紫甘藍色素的影響，結果表明，在不同酸度的溶液中，花色苷分子有四種不同的形態，分別對應不同的顏色。在金屬離子溶液中，由于花色苷分子含酚羥基和γ-吡喃酮環，所以易與Ni2+、Cu2+、Al3+和Pb2+離子發生絡合反應，生成不同顏色的復合物。

實驗設計需要使用微波萃取儀、柱層析分離裝置、旋轉蒸發儀和紫外可見吸收光譜儀等儀器，可以使材料化學專業的同學熟悉完整的由物質制備純化到物質性質研究的整個流程，了解常用的分離提純裝置和測試表征儀器，提高他們的動手能力，綜合運用課堂所學的基礎知識，深化對材料的結構和性質的了解，拓寬知識面，為后續學習和未來的科研道路奠定堅實的基礎。