人臍帶間充質干細胞在帕金森病的應用進展

邵麗詩，馬逸群，梁磊，羅成誠，王家平

（1.昆明醫科大學第二附屬醫院放射科，云南 昆明650101；2.昆明醫科大學第一附屬醫院腫瘤外科，云南 昆明650000；3.臨滄市云縣人民醫院急診科，云南 臨滄675800）

帕金森?。≒arkinson's disease PD）是中樞神經系統（CNS）中第二常見的進行性神經退行性疾病，其病理特征是黑質多巴胺能（DA）神經元進行性損失及出現路易體[1]。PD的典型表現是靜止性震顫、肌強直、運動遲緩和姿勢反射障礙異常的運動障礙和廣泛的非運動癥狀，其中認知能力下降是最常見的非運動癥狀[2]。隨著我國人口老齡化的日益進展，帕金森病的患病率和發病率呈明顯的增長趨勢[3]。目前，PD的治療手段主要為口服左旋多巴的藥物治療[4-5]和深部腦刺激（DBS）[6]及手術等，以達到維持腦內多巴胺和乙酞膽堿的相對平衡。但隨著時間的推移，PD患者的病情呈進行性惡化[7-8]，嚴重影響患者的生活質量，也給患者家庭及社會帶來沉重經濟和心理負擔[9]。由于DA神經元細胞一旦變性壞死則不可再生，細胞替代治療已被認為是治療帕金森病的新方法[10]。人臍帶間充質干細胞（hUC-MSCs）因具有顯著的神經分化特征、免疫調節特征和向腦損傷源遷移等較多優點己被認為是治療PD的種子細胞之一[11]。本文對hUC-MSCs及其在帕金森病治療進展進行綜述。

1 hUC-MSCs的生物學特性及應用

1.1 人臍帶間充質干細胞hUC-MSCs的概況MSCs是一類具有自我更新、增殖和多向分化潛能的成體干細胞，其存在于全身結締組織和器官間質中。hUC-MSCs來源于包裹臍血管周圍的膠樣組織中，即華爾通膠或沃頓膠。早在2003年，Covas等[12-13]分別從人臍靜脈內皮和內皮下層成功分離得到hUC-MSCs。體外培養的hUC-MSCs呈貼壁生長，鏡下呈形態相對均一的梭形細胞，也可見到多角形細胞。細胞周期分析顯示體外擴增傳至30代的hUC-MSCs 80%處于G0～G1期，為正常二倍體，無形態學和增殖特性的改變[14]。與其他來源的MSCs一樣，hUC-MSCs高表達CD73、CD90、CD105，并表達粘附分子標記如CD13、CD29、CD44，CD54，低表達HLA-ABC等MHC-Ⅰ分子標記，不表達CD34、CD45和CD31等造血干細胞標志及HLA-DR、HLA-DA、HLA-DP、HLA-DQ等MHC-Ⅱ分子標記[15-16]。Hochedlinger等[17]發現hUC-MSCs表達胚胎干細胞特異性基因OCT-4，與維持干細胞未分化狀態密切相關，表明臍帶hUC-MSCs具有干細胞特性。hUC-MSCs具有多分化潛能，可向外胚層、內胚層和中胚層細胞分化。體內研究發現hUCMSCs可分化為骨骼肌細胞、心肌細胞、神經細胞等，體外誘導還可分化為成軟骨細胞、成骨細胞、神經膠質細胞、肝細胞、內皮細胞、生殖細胞等[18-21]。

1.2 hUC-MSCs的應用hUC-MSCs可能具有更強的可塑性和極低的免疫原性，已被許多學者認為是應用于細胞治療、組織工程和基因治療理想的靶細胞。近年來，hUC-MSCs開始用于治療心腦、神經、免疫等疾病方面，并證實hUC-MSCs可促進心肌細胞的再生，調節血糖，修復創面和恢復神經功能等，為現代醫療技術發展開拓新的領域。

hUC-MSCs與BMSCs、ADMSCs相比，具有以下優勢：①不受倫理道德問題束縛；②hUC-MSCs從廢棄臍帶組織中獲取，來源廣泛，取材方便，分離提純工藝較簡化，且無創操作，避免了骨髓穿刺痛苦；③從人臍帶獲取的間充質細胞含量較高、增殖能力強；④免疫原性低，在異體移植間無免疫排斥反應或反應較弱；⑤易于轉染外源基因，可作為基因治療的載體，用于細胞治療和基因治療。近年來，隨著干細胞工程的不斷發展，來源于人臍帶的間充質干細胞已經被證實在組織工程領域較好的應用前景。

2 hUC-MSCs與帕金森病

2.1 hUC-MSCs移植治療PD PD發病機制尚不明確，但研究認為炎癥、線粒體功能障礙、氧化應激和促凋亡機制可能參與其病理過程。PD的主要病理改變是選擇性的中腦黑質DA神經元喪失，傳統的治療方法均無法逆轉神經變性和增加DA神經細胞數目，因此，開發新型方法治療PD具有重要意義[22]。神經細胞再生和修復缺損壞死的組織，是治療PD的理想方法[10]，因此，為更充分有效地利用細胞療法，需考慮神經細胞的來源及其在物理和生物學上模擬宿主實質組織的微環境[23]。hUC-MSCs由于可塑性強、免疫原性低、體外擴增能力強、轉染外源基因容易等優勢，已成為的理想靶細胞。截至目前，hUC-MSCs在治療PD研究中，動物實驗主要參考Shetty等[24]的方法制備PD模型，臨床試驗主要采用在上平甲狀軟骨上緣，下至甲狀軟骨卜緣1 cm處行頸動脈穿刺或第3、4腰椎間隙行蛛網膜下腔注射hUC-MSCs。2000年，Woodbury等[25]首次報道BMSC在體外通過誘導分化為神經元細胞。Kopen等[26]通過將標記的大鼠BMSC注射入新生小鼠的側腦室發現其能在體轉化為神經細胞。Fu等[18]將人臍帶MSCs來源的酪氨酸輕化酶陽性細胞移植至PD大鼠模型的紋狀體內可存活4個月以上，并向移植部位的頭、尾兩側遷移約1.4 mm,苯丙胺誘發的大鼠轉圈行為顯著改善。這為尋找治療帕金森病的理想細胞指明了新的方向。Zhao等[27]在體外將hUC-MSCs誘導成多巴胺能神經元（DAergic）與hUCMSCs比較對PD大鼠治療作用，結果發現，hUC-MSCs誘導生成的DAergic對PD大鼠行為學癥狀明顯減輕，優于直接應用hUC-MSCs移植。hUC-MSCs在我國已開展至臨床試驗階段，邱云等[28]經頸動脈注射hUC-MSCs治療8例PD患者，結果表明，患者的日常生活動和運動癥狀得到明顯改善。季興等[29]對38例PD患者行蛛網膜下腔注射hUC-MSCs，1個月后所有患者的UPDRS評分均顯著改善，隨訪期間未出現不良免疫反應。但目前國外通過hUC-MSCs移植治療PD的報道較少。

2.2 hUC-MSCs作為轉基因載體治療雖然hUC-MSCs移植治療在中樞神經系統疾病中領域取得了一些突破性進展，但是移植后的hUC-MSCs存在生存率低、遠期療效不明顯等問題。有研究利用hUC-MSCs作為基因治療的載體以此提高療效。黃仕雄等[30]將認為能促進干細胞向多巴胺能神經元分化有關的細胞核受體超家族的轉錄因子基因Nurrl進行體外修飾hUC-MSCs，發現其較單純hUC-MSCs向DA神經元分化率明顯增加，2009年，又發現移植Nurrl基因修飾hUC-MSCs來源的DAergic治療PD模型鼠，更能有效地促進大鼠腦內DA和紋狀體區酪氨酸輕化酶（tyrosinehydroxylase，TH）含量的表達[29]。樊志剛等[31]對PD大鼠有側腦室注射質粒pEGFP-C2-TH基因修飾的hUC-MSCs后，觀察到移植的細胞活動范圍更大，存活時間更長相對于單純的hUC-MSCs。免疫組化顯示植入酪氨酸羥化酶基因修飾的的細胞TH表達陽性，移植后PD大鼠的紋狀體內多巴胺含量也明顯增加，說明hUC-MSCs聯合基因治療PD的療效優于單獨移植hUC-MSCs，為治療PD提供一種新的策略。除采用基因修飾的方法增加多巴胺的表達量治療PD外，還有一些研究發現移植前用多效生長因子（pleiotro phin，PTN）預處理供體細胞，能更有效改善大鼠的旋轉行為，促進更多的TH陽性細胞存活[32]。

3 hUC-MSCs移植治療的機制

hUC-MSCs移植對治療PD有一定療效，但是其具體作用機制尚未完全闡明，可能通過以下幾種機制促進神經功能恢復。

3.1 神經營養移植后hUC-MSCs能到達局部損傷部位，通過分泌多種生長因子、細胞因子、細胞外基質（ECM）蛋白和有效的神經調節為神經系統創造有利環境的分子再生。hUCMSCs可向周圍釋放多種保護性因子，如神經營養素3（NT3）、神經遞質因子（BDNF）、血管表皮生長因子（VEGF）、IL-6和干細胞因子（SCF）[33-34]等，這些細胞因子通過促進血管再生和發揮抗炎、抗凋亡等從而挽救變性邊緣的DA神經元，提高周圍神經細胞的存活率。另外，hUC-MSCs可產生細胞外基質（ECM）蛋白質，支持神經細胞附著、生長、神經發生和功能修復[31]。因此，hUC-MSCs分泌的多種因子參與DA的保護和修復，這可能部分解釋了hUC-MSCs對PD的治療作用。

3.2 細胞替代移植的hUC-MSCs直接分化DAergic，或激活內源性神經干細胞間接分化為相應類型的神經細胞，替代缺失的DAergic。但目前越來越多的研究表明，細胞替代作用并不是hUC-MSCs作用的主要機制[35-36]。移植的hUC-MSCs在腦內表達神經元及星形膠質細胞的特異性標志物通常低于5%，且其數量在移植后會逐漸下降。因此，hUC-MSCs是否通過細胞分化替代改善神經功能也有待進一步研究。

3.3 免疫調節有研究表明，在PD患者尸檢中觀察到激活的小膠質細胞廣泛增殖[37]。炎癥刺激可誘導小膠質細胞的增殖效應，hUC-MSCs可抑制這種增殖效應并降低小膠質細胞對促炎因子的表達[38]。同時,在PD患者的大腦中檢測到促炎細胞因子水平的升高，如腫瘤壞死因子（TNF）、白細胞介素-1β（IL-1）和干擾素γ（IFN-Y）[39-40]。此外，研究報道PD動物模型的免疫抑制環孢菌素A的表達減弱[41]。說明hUCMSCs的免疫調節和抗炎作用在PD治療的重要性。

4 小結

近年來，干細胞作為一種有希望的修復性治療方法已經成為PD研究領域的前沿，hUC-MSCs作為一種新型種子細胞，具有取材無創、無倫理爭議、低免疫原性等優點，尤其將分娩時遺棄的臍帶作為主要來源。同時，通過基因轉染手段，促進hUC-MSCs定向分化為多巴胺能神經元，為臨床治療PD提供新的思路。但hUC-MSCs治療如何獲得最有效的神經保護作用的移植方案，以及移植時間窗、細胞數目、途徑、安全性等問題，還需要進一步的研究。隨著人們對hUC-MSCs的生物學特性及臨床實踐不斷深入，我國規范的hUC-MSCs庫建立，未來hUC-MSCs將有望成為治療PD的恢復性方法。