安圖質(zhì)譜儀與生化反應(yīng)鑒定血液分離念珠狀鏈桿菌的價值

黃麗月，韋國文

廣西河池市人民醫(yī)院 （廣西河池 547000）

念珠狀鏈桿菌是一種革蘭陰性桿菌兼性厭氧菌，對營養(yǎng)要求較高，在含有血液（15%的羊血或兔血最理想）、血清、腹水或卵黃的強(qiáng)化培養(yǎng)基上生長良好，且生長需要5%～10%二氧化碳，最適生長溫度為35～37 ℃，故巧克力平板較血平板上的菌落大[1]。該菌自然寄居在野生動物或嚙齒類動物的鼻咽部和口咽部，通過鼠咬傷引起鼠咬熱或污染水和食物引起哈弗里爾熱，并常在感染者的血液、滑膜積液、膿腫吸出物中分離到，對實驗小白鼠、靈長類等有極強(qiáng)的致病性[2]。其引起的鼠咬熱潛伏期一般為1～5 d，典型的臨床表現(xiàn)有驟然高熱、肌痛、關(guān)節(jié)痛、嘔吐及頭痛，隨后四肢出現(xiàn)斑丘疹[3]。近年來，由念珠狀鏈桿菌引起的臨床病例均有報道[1，4-7]，但該菌對營養(yǎng)要求較高，生長緩慢，生化反應(yīng)不明顯，常規(guī)方法鑒定不出或鑒定錯誤，故易出現(xiàn)漏診，或被當(dāng)作污染菌，甚至誤診。

近年來，隨著質(zhì)譜分析法的快速發(fā)展，質(zhì)譜技術(shù)愈加成熟，細(xì)菌鑒定時間縮短至2 h 以內(nèi)，同時對疑難雜菌的鑒定有較高的屬水平符合率[8-11]，可為患者治療提供及時、可靠的依據(jù)。本研究采用安圖AUTOF MS1000質(zhì)譜儀，結(jié)合傳統(tǒng)的生化實驗，對我院一起血液感染的細(xì)菌進(jìn)行了鑒定，發(fā)現(xiàn)了由念珠狀鏈桿菌引起的臨床感染，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

患者女，30歲，2020年4月10日因“畏寒，發(fā)熱半天”入院，否認(rèn)野生動物接觸史及外傷史，曾于2019年7月10日在我院就診，檢測出α地中海貧血CS型點突變純合子，CD55、CD59陰性，有輸血史；查體體溫40.2 ℃，貧血貌，全身鞏膜黃染，關(guān)節(jié)疼痛，偶見皮疹；實驗室檢查白細(xì)胞計數(shù)9.86×109/L，中性粒細(xì)胞百分比75.60%，淋巴細(xì)胞百分比19.60%，紅細(xì)胞計數(shù)1.26×1012/L，血紅蛋白37 g/L，血細(xì)胞比容11.90%，C反應(yīng)蛋白5.0 mg/L，降鈣素原4.07 ng/ml；入院診斷發(fā)熱原因待查及α地中海貧血，入院后立即抽取左、右上肢靜脈血進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，第3天左、右上肢血培養(yǎng)均報陽性，轉(zhuǎn)種平板培養(yǎng)，直接涂片鏡下均為革蘭陰性桿菌，培養(yǎng)3 d后觀察，左、右上肢的血平板、巧克力平板肉眼可見大小、形態(tài)較為一致的細(xì)小菌落，根據(jù)患者病情，予以輸血及莫西沙星經(jīng)驗抗感染治療，感染加重，持續(xù)高熱，感染指標(biāo)高，經(jīng)考慮感染控制不住，結(jié)合藥敏實驗結(jié)果及經(jīng)臨床藥學(xué)副主任藥師會診后，建議使用頭孢曲松鈉（注射劑），經(jīng)治療患者病情好轉(zhuǎn)，持續(xù)用藥1周后，再次抽取左、右上肢血進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，培養(yǎng)7 d后結(jié)果為陰性，臨床癥狀明顯好轉(zhuǎn)，予以帶藥出院。

1.2 儀器與試劑

安圖AUTOF MS1000質(zhì)譜儀購自深圳安圖公司；VITEK2-compact 全自動生化鑒定藥敏儀購自法國梅里埃公司；全自動血培養(yǎng)儀及配套需氧培養(yǎng)瓶購自珠海迪爾公司；哥倫比亞血平板、巧克力平板、麥康凱平板購自鄭州安圖公司；革蘭染液購自杭州濱和試劑公司；生化管、藥敏紙片購自杭州濱和試劑公司；質(zhì)控菌株包括大腸埃希菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC25923、銅綠假單胞菌ATCC27853，均來自杭州濱和試劑公司。

1.3 標(biāo)本采集與處理

參照《臨床檢驗操作規(guī)程》第4版中的細(xì)菌鑒定方法，遵循無菌操作原則，分別取患者左、右上肢靜脈血于需氧培養(yǎng)瓶內(nèi)，待血培養(yǎng)報陽性后轉(zhuǎn)種血平板、巧克力平板、麥康凱平板。

1.4 細(xì)菌鑒定

1.4.1 安圖質(zhì)譜儀鑒定

取一次性接種環(huán)分別挑取左、右上肢培養(yǎng)出的菌落涂布在質(zhì)譜檢測孔內(nèi)，室溫干燥，各加入1 μl 裂解液（主要成分為甲酸），待干燥后再分別加入1 μl 基質(zhì)液（主要成分為肉桂酸），干燥后上機(jī)測定。

1.4.2 生化反應(yīng)鑒定

取針樣接種環(huán)分別挑取左、右上肢培養(yǎng)出的菌落做氧化酶、觸酶、脲酶、硝酸鹽還原和吲哚試驗及精氨酸、葡萄糖、麥芽糖等系列生化管反應(yīng)；分別挑取左、右上肢培養(yǎng)出的菌落，配置成0.5麥?zhǔn)暇鷳乙海ITEK2-compact 細(xì)菌鑒定卡片，吸樣上機(jī)孵育8 h 后觀察結(jié)果；藥敏選擇紙片擴(kuò)散法進(jìn)行試驗。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌培養(yǎng)及鏡檢

左、右上肢血培養(yǎng)報警陽性后，轉(zhuǎn)種血平板、巧克力平板、麥康凱平板，1 d 后觀察，左、右上肢的所有平板均無肉眼可見菌落；2 d 后觀察，左、右上肢的血平板和巧克力平板肉眼可見針尖樣大小菌落，形態(tài)不明顯，麥康凱平板均不生長；3 d 后觀察，左、右上肢的血平板和巧克力平板可見圓形、平滑、奶酪樣的灰色菌落，直徑1～2 mm；4～5 d 后觀察，陳舊培養(yǎng)基中菌落類似支原體油煎蛋樣外觀，中心緊密并深入瓊脂（L 型菌落）；5 d 后鏡下為革蘭陰性桿菌，形態(tài)多樣，長短不一，呈球形、球桿形、桿形、梭形、長條形，長度1～5 μm，陳舊培養(yǎng)基染色后鏡下可見100～150 μm 的絲狀體。

2.2 安圖AUTOF MS1000質(zhì)譜儀鑒定結(jié)果

經(jīng)安圖AUTOF MS1000質(zhì)譜儀鑒定，左上肢細(xì)菌鑒定為念珠狀鏈桿菌，最高得分為98.53分；右上肢細(xì)菌鑒定亦為念珠狀鏈桿菌，最高得分為95.28分。

2.3 生化鑒定結(jié)果

VITEK2-compact 全自動生化鑒定藥敏儀對左、右上肢培養(yǎng)出的細(xì)菌均鑒定不出。該菌生化反應(yīng)不活潑，其中氧化酶、觸酶、脲酶、硝酸鹽還原和吲哚試驗均為陰性，可水解精氨酸，微弱發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖。

2.4 藥敏結(jié)果

根據(jù)美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（C l i n i c a l a n d Laboratory Standards Institute，CLSI）2019藥敏標(biāo)準(zhǔn)，以ATCC25922大腸埃希菌為質(zhì)控菌株，手工分析藥敏，結(jié)果為氨芐西林6 mm，頭孢唑林6 mm，頭孢呋辛6 mm，頭孢他啶28 mm，頭孢曲松28 mm，頭孢哌酮/舒巴坦27 mm，左氧氟沙星26 mm，環(huán)丙沙星30 mm，復(fù)方新諾明24 mm，慶大霉素18 mm，阿米卡星21 mm，亞胺培南30 mm，美羅培南32 mm。根據(jù)CLSI 2019藥敏標(biāo)準(zhǔn)，該菌無藥敏判斷標(biāo)準(zhǔn)，臨床醫(yī)師應(yīng)根據(jù)藥敏結(jié)果并結(jié)合患者情況進(jìn)行用藥。

3 討論

念珠狀鏈桿菌是鏈桿屬中唯一的一種，是Sehotmuller于1914年從鼠咬熱患者分離而得，其存在于健康鼠口腔和咽部，為美國鼠咬熱的最主要病因。臨床已發(fā)現(xiàn)，感染的暴發(fā)與飲入未消毒的和被污染的牛奶有關(guān)，當(dāng)疾病是以此種方式傳播時被稱為哈弗里爾熱。然而，感染常是由受染的野生大鼠或小鼠咬傷后發(fā)病，偶爾感染亦可由鼬鼠和其他嚙齒類動物傳播，但本研究中的病例并無直接鼠類或其他野生動物接觸史，發(fā)病迅速突然，有持續(xù)性不規(guī)則高熱、關(guān)節(jié)炎和皮疹。有研究表明，單獨存在的念珠狀鏈桿菌中央可膨脹，而長絲狀菌體呈現(xiàn)一系列的膨脹相連，出現(xiàn)念珠狀的長鏈，最后分裂成球桿形，也會自發(fā)變成L型，將變異株接種于小鼠體內(nèi)，可恢復(fù)其固有形態(tài)[12]。隨著抗生素的普遍應(yīng)用，往往臨床病例分離到的是形態(tài)各異、染色多變的L型菌株[13]，由于該菌體外培養(yǎng)營養(yǎng)要求較高，生長緩慢，若臨床分離中未選擇適合的培養(yǎng)基，且培養(yǎng)時間較短，則會造成一定的漏檢。

血流感染是臨床上重癥感染性疾病之一，致死率高，快速診斷是控制感染、降低病死率的關(guān)鍵[14-15]。傳統(tǒng)的微生物鑒定方法主要包括培養(yǎng)和生化實驗等，耗時長、鑒定范圍窄，影響病原微生物鑒定的速度和準(zhǔn)確性。念珠狀鏈桿菌作為疑難、少見菌，生化反應(yīng)不明顯，VITEK2-compact 并不提供相應(yīng)的鑒定卡，普通的GP、GN 卡并不能鑒定出該菌，勢必給該病原菌的確診造成拖延或誤診，從而影響臨床治療效果。

20世紀(jì)80年代，質(zhì)譜被發(fā)現(xiàn)可以對核糖體蛋白等大質(zhì)量生物分子進(jìn)行分析，鑒于此，質(zhì)譜儀逐漸被用于細(xì)菌檢測中。安圖AUTOF MS1000質(zhì)譜儀根據(jù)不同細(xì)菌所特有的蛋白，應(yīng)用激光使細(xì)胞表面蛋白質(zhì)形成不同的模式峰，與人類病原菌數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)指紋圖譜進(jìn)行比較，從而對該微生物的類別進(jìn)行鑒定，是與傳統(tǒng)鑒定方法完全不同的新型鑒定手段。因其高靈敏度和準(zhǔn)確度，可為微生物體內(nèi)含量較高的蛋白質(zhì)提供細(xì)菌屬、種、株水平的檢測，相較于傳統(tǒng)方法更加快速，且操作簡單、成本低廉。隨著質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展，鑒定的數(shù)據(jù)庫不斷擴(kuò)充、完善，一些操作簡易的商業(yè)化質(zhì)譜儀已經(jīng)走進(jìn)臨床檢驗，質(zhì)譜技術(shù)的應(yīng)用越來越廣泛，并有可能成為現(xiàn)代微生物實驗室細(xì)菌鑒定的常規(guī)方法，這對提高臨床微生物檢驗的能力和水平大有裨益。