手性仿酶催化劑用于純水相制備埃索美拉唑

張瑤瑤,彭文舉,黃 杰,楊世龍,羅 杰,丁 偉,丁 瑜,朱 磊

(1.湖北工程學院 化學與材料科學學院，湖北 孝感 432000；2.孝感市中心醫院，湖北 孝感 432000)

胃潰瘍是一種臨床上發病率和復發率均較高的慢性消化系統疾病，可引發胃穿孔、胃出血、癌變等并發癥。質子泵抑制劑是目前治療消化性胃潰瘍最先進的一類藥物[1]，主要原理是通過抑制壁細胞膜的H-K交換進而抑制壁細胞分泌胃酸的功能，并清除幽門螺旋桿菌[2-4]。目前國內市面上的質子泵抑制劑主要包括埃索美拉唑、泮托拉唑、蘭索拉唑、雷貝拉唑鹽等[5-11]。其中，埃索美拉唑應用最為廣泛，具有起效快、作用強、更持久等優點[12]。埃索美拉唑鎂或埃索美拉唑鈉作為左旋異構體鹽，具有藥物代謝受基因多態影響弱、個體差異小、抑制酸分泌強、無藥物耐受等優異特性[13]，因此該類物質市場需求大。

目前制備埃索美拉唑的方法主要分為拆分法和不對稱氧化法[14-20]。拆分法成本高、收率低，限制了其工業生產效益。另一種方法為不對稱催化氧化法，其關鍵在于制備出成本低、性能優異的催化劑，經過不對稱催化奧美拉唑硫醚底物獲得手性單一S-奧美拉唑[21-23]，并采用各種表征手段確定產物構型及純度[24-29]。Mahale等[30]使用10-樟腦氧氮雜環丙烷作為手性氧化試劑選擇性氧化硫醚，但終產物對映體選擇性并不高。Codexis實驗室[31]成功設計了B-V加氧酶，催化前手性奧美拉唑硫醚氧化成S-奧美拉唑亞砜，在氧氣條件下得到高對映體選擇性手性產物。

Scheme 1

工業生產埃索美拉唑均是在有機相中進行，易造成環境污染。但水相中催化反應存在傳質困難、催化效率低、催化劑難回收等問題，N-異丙基丙烯酰胺(NIPAAm)具有溫度響應性，可在室溫下溶于水，升溫從水相中析出，應用于催化劑載體便可實現催化劑的溫控分離及便捷回收，實現催化劑水相高效催化和有效重復使用[32-34]，從而解決環境污染問題。以PNIPAAm為載體構建的酶催化可用于生物體內水相環境中各類化學反應，位點分離、疏水間隔是酶催化體系的重要特征。響應型聚合物通過在溶液中圍繞催化活性位點自組裝，可形成一種仿酶空腔的納米結構，進而模擬生物酶的高效催化性能。

將溫敏材料和手性氨基酸進行可控聚合制備出單鏈嵌段聚合物，利用金屬鈦鹽與氨基酸的配位作用，結合分子內疏水作用促使單鏈嵌段聚合物發生自單鏈折疊形成納米反應器。采用現代表征手段對催化劑在水溶液中的形貌進行表征，將催化劑用于純水相中研究不對稱催化氧化奧美拉唑性能。反應結束后，通過升溫實現催化劑的便捷回收，考察催化劑回收及重復使用性能，模擬出工業制備埃索美拉唑最優催化路線。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

WZZ—2S/2SS型數字式自動旋光儀；Agilent 8453型紫外光譜儀；Bruker Drx 400 HMz型核磁共振儀(CDCl3為溶劑，TMS為內標)；Vertex 70型紅外光譜儀；Alltech型凝膠色譜儀；Agilent 1100型高效液相色譜儀。

所用試劑均為分析純。

1.2 合成

(1) 溫敏型仿酶催化劑的制備

依次稱取L-苯丙氨酸10 mmol,三乙胺11 mmol，溶解于20 mL無水二氯甲烷中，0 ℃下緩慢滴加30 mL溶有丙烯酰氯(11 mmol)的二氯甲烷溶液。滴加完畢后，緩慢升高溫度至室溫，繼續反應2～8 h。反應結束后，向反應液中添加10 mL飽和NH4Cl溶液，CH2Cl2(2×5 mL)萃取水層，有機層用30 mL飽和NaHCO3洗滌，Na2SO4干燥，濃縮得淡黃色油狀液體。硅膠柱層析(洗脫劑：乙酸乙酯/正己烷=1/1,V/V)純化得目標產物，產率72%；IRν:3283,3063,3030,2959,1732,1659,1632,1543,1406,1316,1296,1268,1191,1126,1066,1031,986,965,915,748,700,668,605,576,516,489 cm-1。

RAFT制備溫敏型手性氨基酸嵌段聚合物：分別取NIPAAm(50 mmol)和上述已制備的含有碳碳雙鍵的手性氨基酸化合物(10 mmol)溶于無水甲醇中，將溶液轉移到Schlenk管中，硫代丙酸卞酯0.0330 g(0.2 mmol)和AIBN 0.0052 g(0.03 mmol)加入到反應液中。N2保護下，將反應液置于60 ℃反應24 h，反應結束后，真空濃縮反應液，多倍過量乙醚做沉淀劑處理反應液，得到淡黃色固體產物，30 ℃真空干燥，得手性氨基酸嵌段聚合物PN50A10。

表1 5種不同親疏水比例催化劑表征Table 1 Characterization of five catalysts with different hydrophilic and hydrophobic ratios

Scheme 2

取4 mmol上述制備的PN50A10溶于無水二氯甲烷中，待溶解充分后加入2 mmol四異丙基鈦酸酯，室溫反應8 h。旋干溶劑，加入2 mL四氫呋喃溶解產物，2滴水振蕩，減壓抽濾后旋干溶劑，適量乙醚反復沉淀得到黃色固體沉淀，30 ℃下，真空干燥得到催化劑TiIV-PNxAy，產率86%；IR:3423,3062,2965,1728,1614,1556,1454,1395,1135,1105,1044,924,836,675,617,558,511 cm-1。

(2) 5-甲氧基-2-[(4-甲氧基-3,5-二甲基-2-吡啶基)甲硫基]-1H-苯并咪唑的合成

取10 mmol 2-氯甲基-3,5-二甲基-4甲氧基吡啶鹽酸鹽和10.5 mmol 5-甲氧基-2-巰基苯并咪唑溶于40 mL甲苯中，溶液轉移至100 mL反應釜中，加入0.4 mmol四甲基溴化銨(TBAB)，緩慢滴加2 mL質量分數為20 %的氫氧化鈉溶液，將反應釜置于60oC反應4 h。反應結束后，冷卻到室溫，調節pH至7～8之間，靜置分層。采用甲苯(3×10 mL)萃取水層，合并有機相，熱水洗滌，減壓濃縮，降溫結晶，減壓抽濾，60 ℃真空干燥。得到白色固體，收率86%；1H NMR(CDCl3,500 MHz)δ:2.23～2.31(s,6H),3.78(s,3H),3.83(s,3H),4.35(s,2H),6.80～6.81(dd,2H),7.03(s,1H),7.40(s,1H) ,8.26(s,1H)；13C NMR(CDCl3,125 MHz)δ:165.1,156.0,148.4,126.4,125.5,111.0,60.1,55.8,35.1,13.4,11.3。

(3) 埃索美拉唑的合成

向10 mL反應瓶中加入適量催化劑TiIV-PNxAy，取1 mL溶劑將催化劑溶解后，加入1 mmol的底物5-甲氧基-2-[[(4-甲氧基-3,5-二甲基-2-吡啶基)甲基]硫基]-1H-苯并咪唑硫醚。反應瓶置于25℃條件下恒溫，緩慢滴加1.2 mmol 30 %H2O2(TCL檢測)。剩余溶劑用CH2Cl2(3×10 mL)萃取，濃縮得到紅色油狀液體，加入少量丙酮析出固體、過濾、甲醇洗滌，得到白色固體，硅膠柱層析(洗脫劑：甲醇/二氯甲烷=2/8,V/V)純化得埃索美拉唑，收率95%;1H NMR(CDCl3,500 MHz)δ:2.06～2.16(s,6H),3.54(s,3H),3.78(s,3H),4.73～4.76(AB-system,2H),6.87～6.90(dd,2H),7.48(d,1H),8.14(s,1H)；13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ:164.2,157.2,151.5,149.5,148.6,126.8,126.2,113.9,60.5,59.7,55.6,13.2,11.3。

(4) 埃索美拉唑鈉的合成

2 結果與討論

2.1 表征

(1) FT-IR

采用FT-IR表征了聚N-異丙基丙烯酰胺PNIPAAm(a)；新鮮溫敏型氨基酸鈦催化劑TiIV-PN50A10(b)，回收催化劑TiIV-PN50A10(b′)，結果如圖1所示。

由圖1可得，溫敏聚合物PNIPAAm在3309 cm-1和3072 cm-1表現出—CONH—中—NH—的特征峰，在2973，2930 cm-1表現出—CH—CH—中—CH—的特征峰，在2876 cm-1表現出—CH(CH3)2中—CH3的特征峰，1653 cm-1和1540 cm-1表現出—CH(CH3)2中—CH—的伸縮振動峰，與之前所報道一致[32](圖a)。上述這些特征峰在催化劑TiIV-PN50A10中依然存在，證明催化劑結構中含有溫敏單元聚合物。此外，催化劑TiIV-PN50A10在704 cm-1出現金屬Ti—O—Ti配位的特征峰，證明金屬鈦成功配位到氨基酸單元的氮原子上(圖1b)，催化劑結構符合設計。在此基礎上，對回收后的催化劑同樣進行紅外表征，結果表明，回收后的催化劑與新鮮催化劑結構吻合，催化劑在反應前后，結構并未被破壞(圖1b′)。

ν/cm-1圖1 聚合物PNIPAAm(a)，新鮮催化劑TiIV-PN50A10(b)和回收催化劑TiIV-PN50A10(b′)FT-IR譜圖Figure 1 FT-IR spectra of PNIPAAm(a),fresh TiIV-PN50A10(b),TiIV-PN50A10 reused for six times(b′)

2.2 催化劑性能

(1) 5種催化劑性能比較

為了篩選出性能優越的催化劑，將5種不同親疏水比例催化劑用于水相催化奧美拉唑的不對稱氧化反應，其結果如下表2所示，各催化劑反應動力學如圖2所示。

由表2可得，不同親疏水比例中，催化劑TiIV-PN50A10的催化效果最好，所得到的收率和對映體選擇性均最高(收率達到95%，對映體選擇性高達98%)，幾乎可實現硫醚定量轉化成對應手性亞砜產物。當減少親水端比例時，所形成的納米反應器外層親水基團減少，不能很好的將疏水底物硫醚包裹進疏水納米反應空腔內部，因此導致催化劑TiIV-PN30A10和TiIV-PN40A10的催化效果均有所下降。增加親水端比例時，催化劑TiIV-PN60A10和TiIV-PN70A10中疏水活性中心減少，催化活性減弱，反應相同時間，產率和對映選擇性均下降。綜上，選擇催化劑TiIV-PN50A10進行催化反應性能考察。

表2 不同親疏水比例催化劑應用于純水相不對稱奧美拉唑氧化反應Table 2 The asymmetric omeprazole oxidation catalyzed by different catalysts in water

如圖2所示，溫敏型催化劑在反應開始時，均表現出較低的催化效率。直至90 min后，反應速率迅速增大，隨后反應速率呈線性增長。這一趨勢表明，催化劑在水中形成納米反應器，反應初期，硫醚底物緩慢進入納米反應器內部，當底物濃度達到一定后，疏水空腔內部的底物與活性中心急劇碰撞，從而加快反應速率，表現出酶催化的特性。因此，該法制備的催化劑表現出極高的催化效率，可大大提高工藝生產效率，并解決環境污染問題。

Time/min圖 2 各催化劑反應動力學Figure 2 Kinetic curves of asymmetric omeprazole oxidation catalyzed by different catalysts in water

(2) 溶劑效應

為了觀察催化劑在水中反應的實時動態，采用動力學研究反應過程。反應溶劑對于催化反應過程中納米反應器的構筑至關重要，因此，研究了不同溶劑中催化劑的催化性能，結果如表3所示。

表3 不同溶劑的影響Table 3 The effect of different solvents

由表3可見，溶劑為水時，催化劑TiIV-PN50A10效果最好。在水溶液中，催化劑溶解性良好，在水中分子內疏水作用力下可自折疊形成納米反應器，疏水活性中心包裹在納米反應器內部。加入有機反應底物奧美拉唑硫醚后，在疏水驅動力下，底物進入納米反應器內部被大量富集。水相氧化劑雙氧水緩慢進入納米反應器內部，與足量硫醚劇烈碰撞，從而加速反應進行，納米反應器可有效阻止氧化劑過量形成砜。因此，催化劑TiIV-PN50A10在水中相比有機溶劑可獲得更高的產率和對映體選擇性，表現出仿生催化特性。催化劑在有機溶劑中不能通過自組裝形成納米反應器，因此，有機相催化反應效率低、對映體選擇性差。

(3) 其它底物

將性能最優催化劑用于不同底物的考察，結果如表4所示。由表4可得，催化劑TiIV-PN50A10應用于不同底物均具有良好的催化效果，在純水相反應體系中，室溫條件下，反應3 h均能得到較高的產率和對映體選擇性。蘭索拉唑反應3 h實現92%的收率和97%的對映體選擇性，因此該類催化劑在水溶液中可自組裝形成納米反應器，疏水底物進入納米反應器空腔，實現高效催化，解決了催化劑水相催化傳質差、效率低等問題，表現出仿生催化的特性。同時，奧美拉唑亞砜、蘭索拉唑亞砜、泮托拉唑亞砜和雷貝拉唑亞砜均屬手性藥物，該法可制備出高收率、高對映體選擇性手性產物，在工業中具有很好的應用前景。

表4 不同底物應用于純水相不對稱催化氧化反應Table 4 Results of asymmetric oxidation over different substrates

(4) 催化劑循環性

將經過升溫、洗滌、干燥后回收的催化劑重新置于水溶液中溶解后，加入反應物開始重復實驗，實時監控反應，待反應結束后分離催化劑和產物，計算產率和對映體選擇性等。

催化劑TiIV-PN50A10重復使用5次，產物埃索美拉唑的產率基本保持不變，對映體選擇性可維持在94%以上。將催化劑配制成濃度為0.5 mg/mL的水溶液，測量其升溫和降溫過程中紫外透光率的變化，結果表明，催化劑具有良好的溫度響應性，經過反復升溫降溫，其紫外響應信號依然靈敏。該項研究表明，通過RAFT法制備得到的溫敏型手性氨基酸鈦催化劑可實現重復使用。

(1) 以自然界中來源廣泛的手性氨基酸和工業化溫敏材料N-異丙基丙烯酰胺為原料，采用RAFT法，制備出系列溫敏型聚合物PNxAy，并利用金屬配位作用得到溫敏型氨基酸鈦催化劑TiIV-PNxAy，制備方法簡單，工業可操作性強。

(2) 將催化劑用于純水相不對稱硫醚氧化反應中，僅1.0 mol%催化劑反應3 h，即實現埃索美拉唑收率達95%，對映體選擇性高達98%。可定量獲得手性單一的埃索美拉唑藥物，表現出仿生催化特性，詳細探究了催化劑親疏水比例、動力學、溶劑等影響因素，得到最優催化反應體系。

(3) 催化劑室溫下可很好的溶于水，升溫即可從水相中的析出，實現催化劑的溫控便捷回收和重復使用，實驗室可重復使用5次以上。