梅花鹿Galectin-1 基因克隆及生物信息學(xué)分析

張淑萍 張厚鋒 孔娜 溫海燕 周宛蓉 姜莉莉 樊兆斌*

（1，山東省菏澤市食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院 274000；2，菏澤學(xué)院藥學(xué)院 274715）

半乳糖凝集素（Galectin）屬于S 型凝集素，是一類不依賴鈣離子的可溶性凝集素，在脊椎動物、無脊椎動物、原生動物和真菌等各種生物體內(nèi)廣泛存在。Galectin 結(jié)構(gòu)上具有保守的糖識別結(jié)構(gòu)域（CRD），對β-半乳糖苷具有廣泛的親和力，具有獨(dú)特的結(jié)合位點(diǎn)和序列基序。通過與宿主細(xì)胞表面糖蛋白結(jié)合，對細(xì)胞生長、粘附、遷移和免疫反應(yīng)等多種生物學(xué)功能產(chǎn)生影響[1]。β-半乳糖通過識別宿主細(xì)胞表面的糖蛋白發(fā)揮功能[2]。研究者對Galectin 的研究主要集中于其對參與先天和適應(yīng)性免疫應(yīng)答細(xì)胞的不同作用，以及其在免疫穩(wěn)態(tài)中的調(diào)節(jié)作用機(jī)制。近些年，越來越多的研究結(jié)果表明，Galectin 還可以與潛在致病微生物、寄生蟲和真菌表面的外源性聚糖結(jié)合，提示Galectin 在先天免疫中可以作為模式識別受體（PRRs）發(fā)揮作用，在宿主細(xì)胞發(fā)育和免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)過程中也有識別多糖的功能[3]。目前，哺乳動物半乳糖凝集素有15 個(gè)已被鑒定[4]。在人類半乳糖凝集素家族中，Galectin-1 是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的成員，Galectin-1 屬于同源二聚體的凝集素，存在于多種組織和細(xì)胞內(nèi)，參與細(xì)胞的增殖、凋亡、粘附和炎癥反應(yīng)等多種生理過程，且與免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)和腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5]。研究表明，Galectin-1 參與多種病毒的生命活動，尼帕病毒感染內(nèi)皮細(xì)胞后，Galectin-1 蛋白抑制病毒衣殼糖蛋白和宿主細(xì)胞之間的熔合并且通過樹枝狀細(xì)胞促進(jìn)促炎癥反應(yīng)細(xì)胞活素的釋放[6]。牙鲆受到病毒感染時(shí)，Galectin-1 能快速參與機(jī)體的抗病毒反應(yīng)[7]。Galectin-1 能與流感病毒結(jié)合，改善病原的致病性[8]。Galectin-1 誘導(dǎo)HIV-1 感染T 細(xì)胞的凋亡與細(xì)胞表面糖蛋白的糖基化改變相關(guān)，細(xì)胞表面糖蛋白的唾液酸化增加，Galectin-1 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡會被抑制，反之亦然[9]。本研究克隆梅花鹿Galectin-1 基因，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析預(yù)測，為進(jìn)一步研究Galectin-1 編碼蛋白功能提供有價(jià)值的參考資料。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

cDNA 第一鏈合成試劑盒、動物組織總RNA 提取試劑盒、2×Taq PCR Mastermix、D2000 DNA Marker、膠回收試劑盒、pGM-T 載體，質(zhì)粒提取試劑盒、DH5α 感受態(tài)細(xì)胞等均購自天根公司；LB 培養(yǎng)基，購自Solarbio 公司；BamH I 與Xho I 購自Thermo Fisher 公司。

1.2 試驗(yàn)樣品

梅花鹿肝臟組織。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)ncbi 數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的梅花鹿Galectin-1 mRNA 序列（登錄號MG882483.1），設(shè)計(jì)合成梅花鹿Galectin-1 基因擴(kuò)增引物Gal-1F/Gal-1R。Gal-1F:5'-CGCGGATCCATGGCTTGTGGTCTGGTCGCC-3'，Gal-1R:5'-CCGCTCGAGTCACTCAAAGGCCACACACTT-3'，上下游引物分別引入BamH I 與Xho I 酶切位點(diǎn)，引物由華大基因有限公司合成。

1.4 梅花鹿Galectin 1 基因PCR 擴(kuò)增

提取梅花鹿肝臟組織RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板，用引物Gal-1F/Gal-1R 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系:cDNA1μL，上游引物2μL，下游引物2μL，2×TaqPCRMaster-Mix25μL，ddH2O20μL，共50μL。PCR 反應(yīng)程序：94℃預(yù)計(jì)變性5min，94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共35 個(gè)循環(huán)；最后，經(jīng)72℃延伸10min 后4℃保存。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，后進(jìn)行膠回收。

1.5 PCR 產(chǎn)物連接、轉(zhuǎn)化及測序

將膠回收產(chǎn)物16℃條件下過夜連接pGM-T 載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，涂布LB （A+抗性）固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單個(gè)圓滑白色菌落于4mLLB （A+抗性）液體培養(yǎng)基，于37℃條件下180rpm 搖菌培養(yǎng)16h，后用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。經(jīng)PCR 篩選陽性重組質(zhì)粒，選取3 個(gè)陽性克隆送華大基因公司進(jìn)行序列測定。

1.6 Galectin-1 編碼蛋白理化特性及生物信息學(xué)分析

使用ProtParam 在線工具對Galectin-1 編碼蛋白理化特性進(jìn)行預(yù)測分析。利用Protscale、TMHMM2.0 等在線軟件分析Galectin-1 翻譯氨基酸序列的疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)。采用SignalP-5.0Server 預(yù)測蛋白信號肽，利用NetPhos3.1Server，NetOGlyc4.0和NetNGlyc1.0 進(jìn)行潛在磷酸化位點(diǎn)及潛在O、N 糖基化位點(diǎn)預(yù)測。利用在線分析軟件 （http://Imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl）進(jìn)行抗原決定簇預(yù)測。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 Galectin-1 基因PCR 擴(kuò)增

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖1，擴(kuò)增目的基因片段在400bp 左右，與預(yù)期結(jié)果一致。

圖1 Galectin 1 基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果

2.2 Galectin-1 基因核苷酸序列分析

用DNA Star 軟件對梅花鹿Galectin 1 基因測序進(jìn)行分析，結(jié)果表明，梅花鹿Galectin-1 基因的編碼區(qū)全長408bp，編碼135 個(gè)氨基酸。A （22.06%）、T （21.32%）、G （28.92%）、C（27.7%），其中鳥嘌呤 （G）含量最高，且 （G+C）%為56.62%，提示Galectin1 蛋白為穩(wěn)定蛋白。

2.3 Galectin 1 基因編碼蛋白理化特性及生物信息學(xué)分析

使用在線工具ProtParam 對Galectin-1 編碼蛋白序列分析，結(jié)果表明梅花鹿Galectin-1 編碼蛋白理論分子量為14.69 kD，分子化學(xué)式為C650H1004N178O197S7，理論等電點(diǎn)為5.1，不穩(wěn)定系數(shù)為14.87，推測該蛋白為穩(wěn)定蛋白。哺乳動物網(wǎng)織紅細(xì)胞中半衰期為30h，脂肪系數(shù)為81.04。利用ExPASy ProtScal 程序，對Galectin-1 基因編碼產(chǎn)物的親/疏水性分析，其疏水性圖譜如圖2 所示，整個(gè)多肽鏈有4 個(gè)明顯的親水區(qū)；該氨基酸序列內(nèi)超過半數(shù)為親水性殘基，整條多肽鏈表現(xiàn)為親水性，總平均親水指數(shù)為-0.145。

圖2 Galectin-1 編碼蛋白親/疏水性預(yù)測

利用在線跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件TMHMM2.0 進(jìn)行Galectin-1編碼蛋白序列跨膜區(qū)分析，結(jié)果表明，該蛋白不含跨膜區(qū)，均為胞外區(qū)。信號肽預(yù)測結(jié)果顯示，Galectin-1 編碼蛋白不含信號肽。潛在磷酸化位點(diǎn)預(yù)測結(jié)果表明，閾值0.5 時(shí)，Galectin-1編碼蛋白存在1 個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，位于肽鏈的第98 位的蘇氨酸（圖3）。利用軟件NetOGlyc 4.0 和NetNGlyc 1.0 進(jìn)行潛在O、N 糖基化位點(diǎn)預(yù)測，結(jié)果顯示Galectin-1 編碼蛋白不存在潛在的O-糖基化和N-糖基化修飾位點(diǎn)。

圖3 Galectin-1 編碼蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測結(jié)果

抗原決定簇預(yù)測結(jié)果表明，Galectin-1 編碼蛋白平均抗原傾向指數(shù)為1.0297，如圖4 所示，共含有7 個(gè)抗原決定簇區(qū)域，分別位于4～10，13～22，24～33，40～46，56～62，76～91 及114～123 位氨基酸殘基。表明Galectin-1 編碼蛋白含有較多的優(yōu)勢抗原表位結(jié)構(gòu)，抗原傾向指數(shù)高。

3 討論

圖4 Galectin 1 編碼蛋白抗原決定簇預(yù)測結(jié)果

Galectin-1 是一種與β-半乳糖苷結(jié)合的哺乳動物凝集素，參與了許多信號通路和與癌癥及免疫紊亂相關(guān)的免疫反應(yīng)[10]。早期對Galectin 生物學(xué)功能的認(rèn)識僅局限于在胚胎發(fā)生和早期發(fā)育中的內(nèi)源性碳水化合物配體的識別，后來隨著其在脂肪形成、組織修復(fù)、癌癥和調(diào)節(jié)免疫穩(wěn)態(tài)中作用的發(fā)現(xiàn)，其生物學(xué)作用顯著擴(kuò)大[11]。近些年，越來越多的證據(jù)表明，Galectin 可以結(jié)合潛在致病微生物表面的聚糖，在先天免疫中發(fā)揮識別和效應(yīng)因子作用。Galectin 不僅可以作為模式識別受體，還可以作為效應(yīng)因子，通過與微生物表面結(jié)合并抑制粘附和/或進(jìn)入宿主細(xì)胞，通過破壞病原體表面結(jié)構(gòu)，或通過促進(jìn)吞噬、包埋、自噬和清除循環(huán)中的病原體直接殺死潛在病原體[12]。同時(shí)，一些病毒或細(xì)菌也可以利用Galectin 的識別作用，成功地附著和入侵宿主細(xì)胞。

Galectin 調(diào)控的先天免疫識別和效應(yīng)器機(jī)制，雖然仍能預(yù)防或抵抗病毒、細(xì)菌和寄生蟲感染，但需要通過其表面糖蛋白的獨(dú)特進(jìn)化以適應(yīng)進(jìn)入宿主，并獲得有效的機(jī)制來逃避宿主的免疫應(yīng)答[12]。通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、血管生成、遷移、細(xì)胞免疫逃逸等多種生物學(xué)功能抑制Galectin，在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用，已被認(rèn)為是癌癥治療的潛在治療手段之一[13]。Galectin 也被認(rèn)為是癌癥診斷、預(yù)后和治療情況的生物標(biāo)志物。研究表明，Galectin 極大地加速了HIV-1 與易感細(xì)胞的結(jié)合動力學(xué)，通過特異性結(jié)合CD4 細(xì)胞，導(dǎo)致病毒入侵更為迅速，病毒復(fù)制更為強(qiáng)勁。因此，Galectin 被認(rèn)為是用于開發(fā)新的治療癌癥和艾滋病藥物的一種有前途的分子靶點(diǎn)[13]。

Galectin-1 以依賴乳糖的方式促進(jìn)病毒粒子結(jié)合和靶細(xì)胞感染，提示Galectin-1 是在HIV-1 發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要功能的宿主因子，能加強(qiáng)或促進(jìn)HIV-1 與易感細(xì)胞的關(guān)鍵相互作用[14]。HIV-1 利用宿主聚糖結(jié)合蛋白Galectin-1 增加其對宿主細(xì)胞的附著，從而增加其在易感細(xì)胞中的傳染性。在HIV-1 感染的細(xì)胞模型中具有特異抑制Galectin-1 活性的主要化合物，Galectin-1 可降低抗HIV-1 藥物靶向病毒早期復(fù)制的效率，因此，Galectin-1 特異性抑制劑可作為治療HIV-1 感染的一類新的化合物[15]。本研究克隆梅花鹿Galectin-1 基因，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析預(yù)測，為進(jìn)一步研究Galectin-1 編碼蛋白功能提供有價(jià)值的參考資料。