血清TNF表達及TNF-β 252G/A位點多態性與子宮內膜異位癥易感性的相關性分析

楊賢慧，方霞，劉愛玲，施俊柱

(1. 深圳市龍華區人民醫院 檢驗科，深圳 518109；2. 深圳市龍華區中心醫院 檢驗科，深圳 518110)

子宮內膜異位癥(endometriosis，EMT)是指子宮內膜的腺體和/或間質等組織在子宮肌層以外的其他部位生長和浸潤所引起的一種育齡婦女常見疾病，發病率10%～15%，可導致婦女痛經、不孕[1-2]。EMT的發病機制至今仍未被闡明，有研究表明，其發病與機體免疫功能異常及有無EMT家屬史關系密切，有家屬史的人群EMT發病率為無家族史者的6～7倍[3]。TNF是一種具有多種生物活性的細胞因子，通過與其他促血管生成因子相互作用在EMT的發生發展過程中發揮重要作用[4]。TNF基因多態性指TNF及其受體基因片段的部分堿基發生變化，而這些變化與一些自身免疫性疾病患者血清中TNF水平關系密切[5-6]。基因多態性因不同地區和種族人群的遺傳背景、生活方式及環境等諸多因素的不同而存在一定差異。因此，研究對深圳地區107例EMT患者和120例健康女性血清TNF水平及TNF-β252G/A位點多態性進行了檢測分析，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象收集2017年5月至2019年3月于深圳市龍華區人民醫院就診的EMT患者107例，同時收集體檢健康育齡女性120例為對照，研究對象一般資料如下(表1)。研究對象排除糖尿病、腫瘤、甲狀腺功能和肝腎功能不全等疾病及嚴重營養不良并使用過激素者，同時確保2組研究對象均無血緣關系。該研究經醫院醫學倫理委員會批準并獲得患者及其家屬的知情同意簽字。

1.2 試劑與儀器全血DNA提取試劑盒，購自亞能生物技術(深圳)有限公司；TNF ELISA測定試劑盒，購自上海森雄科技實業有限公司。AE275全自動酶聯免疫分析儀，來自深圳市愛康生物科技有限公司；ABI7500實時熒光定量PCR儀，來自美國應用生物系統公司。

1.3 方法

1.3.1 樣本的采集 采集研究對象清晨空腹靜脈血4～5 mL，將其中2 mL加入EDTA-K2一次性抗凝管中混勻，用于TNF-β252G/A位點多態性的分析；將剩余樣本加入一次性干燥管內，室溫靜置30 min后離心分離血清用于TNF-α和TNF-β水平的測定。

表1 研究對象一般資料

1.3.2 血清TNF-α和TNF-β水平的測定 ELISA檢測研究對象血清TNF-α和TNF-β水平，所有操作嚴格按照儀器和試劑盒使用說明書及科室SOP操作規程進行，確保同等條件下2組檢測結果的準確性和可比性。

1.3.3 全血DNA的提取 采用試劑盒提取全血DNA，所有操作均嚴格按照試劑盒及儀器使用說明書進行，提取后檢測其結構的完整性，確認后采用紫外分光光度計檢測其濃度和純度，合格后于-20 ℃保存備用。

1.3.4TNF-β252G/A位點多態性的分析 檢測步驟為(1)引物設計：上游引物為5′-CCGTGCTTCGTGCTTTGGACTA-3′，下游引物為5′-AGAGCTGGTGGGGACATGTCTG-3′；(2)PCR擴增體系：PCR反應物總體積為30 μL，其中包括DNA模板5 μL，2 mmol/L dNTP 2 μL，10×PCR緩沖液4 μL和上、下游引物各0.2 μmol/L及TaqDNA聚合酶2.5 U；(3)PCR擴增程序：94 ℃預變性10 min，94 ℃變性30 s→60 ℃退火30 s→72 ℃ 45 s，共循環30次，最后72 ℃延伸5 min；(4)電泳：取PCR擴增產物25 μL，加入8 U/μL NcoⅠ限制性內切酶10 U，10×酶切緩沖液3 μL，用雙蒸水調整溶液體積至30 μL，37 ℃酶切12 h；將溶液加入含溴化乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠的負極端孔內，于100 V電泳30 min后取出，分析其基因型。

2 結果

2.1 不同組別研究對象血清TNF水平的比較EMT患者血清TNF-α和TNF-β水平分別為(2.91±1.27) μg/L和(726.08±265.23) ng/L，顯著高于對照組的(1.52±0.57) μg/L和(379.42±213.75) ng/L(均P<0.05， 表2)。

表2 不同組別研究對象血清TNF-α和TNF-β水平比較

2.2 不同分期EMT患者血清TNF水平的比較EMT患者血清TNF-α和TNF-β水平隨著EMT病情分期的加重而升高，不同分期結果之間的差異有統計學意義(均P<0.05， 表3)。經Spearman相關性分析，TNF-α和TNF-β水平與病情分期呈正相關(r=0.695 4、0.770 5，圖1)。

表3 不同分期EMT患者血清TNF水平的比較

2.3 不同組別研究對象血清TNF-β252G/A位點多態性的比較EMT組患者血清AA基因型和A等位基因檢出率分別為21.50%和42.52%，顯著高于對照組的8.33%和25.42%(均P<0.05，表4)。

圖1 TNF水平與EMT疾病分期的相關性

表4 不同組別研究對象血清TNF-β 252G/A 位點多態性的比較

2.4 PCR檢測不同組別研究對象血清TNF基因型EMT組和對照組均于555 bp、185 bp及有740 bp處有3條電泳帶，其中3條帶同時出現的為GA基因型，于555 bp和185 bp處出現2條帶的為AA基因型，僅于740 bp處出現1條帶的為GG基因型(圖2)。

2.5 不同基因型EMT患者血清TNF水平的比較攜帶TNF-β252G/A位點AA基因型的EMT患者血清TNF-β水平為(915.63±327.51) ng/L，顯著高于GA和GG基因型的(632.92±213.75) ng/L和(487.45±170.47) ng/L(P<0.05)，但不同基因型EMT患者血清TNF-α水平的差異無統計學意義(P>0.05)。(表5)

注：1、3、5為EMT組， 2、4、6為對照組。1、2為AA基因型，3、4為GA基因型，5、6為GG基因型。圖2 TNF-β 252G/A位點擴增產物電泳結果

表5 不同基因型EMT患者血清TNF水平的比較

3 討論

EMT是育齡女性較為常見的婦科疾病之一，臨床表現多樣，主要有痛經、慢性非周期性盆腔痛、性交痛及月經異常，嚴重者可引起女性不孕[7-8]。有研究發現，不孕女性中EMT患病率為25%～35%，盆腔痛女性中為39%～59%[9]，痛經女性中約為50%[8]。另外， EMT可增加患者自身免疫性疾病、腫瘤、哮喘及炎癥性腸病等多種慢性疾病的發病風險[10]，且該病復發率高達20%～40%。同時，EMT具有類似惡性腫瘤的局部種植、浸潤生長及遠處轉移能力，嚴重影響育齡女性的健康和生活質量。EMT發病機制尚未完全被闡明，有關文獻[11]表明，EMT患者一級親屬及單卵雙胞胎的發病率較高，約51%的EMT患者發病與遺傳因素及某些基因突變所引起的細胞因子異常等有關。因此，探索EMT的發病機制及新的診斷指標對該病的診斷、治療、預防及降低復發率意義重大。

TNF是機體T細胞分泌的具有多種生物活性的淋巴毒素之一，通過與其相應的受體結合，誘發炎癥反應并刺激T、B細胞及胸腺細胞等生長，在抗腫瘤和抗病毒感染中發揮重要作用。有研究表明，EMT患者血清中TNF水平明顯升高，且與疾病嚴重程度、分期正相關[12-13]。該研究結果顯示，深圳市龍華區EMT患者血清TNF-α和TNF-β水平顯著高于健康對照者(均P<0.05)，這可能與EMT病灶內新生血管形成和盆腔粘連有關，與余鴻標等[13]的報道相一致。而且，相關細胞因子水平隨著EMT患者病情嚴重程度的加重而呈上升趨勢，兩者呈正相關(r=0.695 4、0.770 5)，不同EMT分期患者TNF-α和TNF-β水平之間差異有統計學意義(均P<0.05)，與余鴻標等[13]的報道存在一定差異，這可能與不同地區研究人群的來源、檢測方法及儀器的不同有關，具體原因有待進一步研究。

研究表明，EMT的發病與患者個體的遺傳易感性相關。TNF位于HLA-β和HLA-C2之間，與MHC及TNF-α緊密連鎖，其中位于TNF第1啟動子的TNF-β252G/A位點與限制性內切酶的識別密切相關，最易發生位點突變。研究表明，TNF-β252G/A位點基因突變與EMT的發生發展關系密切[13]。該研究結果顯示，深圳市龍華區EMT患者血清中TNF-β252G/A位點AA基因型及A等位基因檢出率顯著高于健康對照組(P<0.05)，這表明該位點的AA基因型可能是該地區EMT發病的遺傳易感基因之一，與余鴻標等[13]的報道相一致，但與車坤蘭等[14]的不一致。這可能與不同地區和種族人群的遺傳背景、生活習慣及生活環境等諸多因素不同有關。研究結果還顯示，攜帶AA基因型的EMT患者血清中TNF-β水平顯著高于其他基因型(均P<0.05)，而不同基因型的EMT患者血清中TNF-α水平無顯著差異(P>0.05)，這可能與TNF-β252G/A位點突變主要影響TNF-β水平有關。

綜上所述，EMT患者血清TNF-α和TNF-β水平顯著高于健康對照組，與病情分期呈正相關，且攜帶TNF-β252G/A位點的AA基因型EMT患者血清中TNF-β水平顯著高于其他基因型，該基因型可能是該區育齡婦女EMT發病的危險基因型之一。但是，單一基因突變在EMT發生和發展中的作用會受不同地區和種族人群的遺傳背景、生活環境及飲食習慣等諸多因素的影響而存在一定差異。因此，加強有關不同地區和種族育齡女性血清TNF水平及其基因位點突變的調查分析，對EMT患者的早發現、早診斷、早治療及早預防具有重要臨床意義。