哮喘-慢性阻塞性肺疾病患者外周血Treg/Th17失衡的研究

時靖峰，韓明鋒，滕小寶，張小華

(阜陽市第二人民醫(yī)院 呼吸與危重癥科，阜陽 236015)

支氣管哮喘和慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease， COPD)是臨床常見的2種氣道阻塞性疾病，部分患者會出現(xiàn)哮喘和COPD并存的情況，稱為哮喘-慢性阻塞性肺疾病(asthma-chronic obstructive pulmonary disease overlap， ACO)[1]。流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，ACO好發(fā)于中老年人且其發(fā)病率逐年升高，嚴(yán)重影響公民健康[2]。目前，ACO的發(fā)病機(jī)制尚未完全明晰，但普遍認(rèn)為氣道炎癥、阻塞及其高反應(yīng)性是疾病重要的病理生理基礎(chǔ)，其中系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)是關(guān)鍵環(huán)節(jié)[3]。Treg和Th17是重要的免疫組分，其在維持機(jī)體免疫平衡方面作用突出[4]。大量研究指出，Treg/Th17失衡可能與哮喘、COPD的發(fā)生密切相關(guān)[5-6]。ACO兼具哮喘和COPD的臨床表現(xiàn)，但其臨床特征、病理生理機(jī)制及相關(guān)診斷指標(biāo)仍不明確完善。研究將比較ACO、哮喘、COPD患者外周血Treg、Th17及其細(xì)胞因子水平和肺功能，初步分析它們的診斷價值，以提高臨床ACO的診斷水平。

1 資料與方法

1.1 納入標(biāo)準(zhǔn)收集2018年6月至2019年6月于阜陽市第二人民醫(yī)院就診的ACO患者52例(ACO組)，哮喘急性發(fā)作期患者34例(哮喘組)，COPD急性加重期患者45例(COPD組)及健康體檢者30例(健康組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)ACO患者符合西班牙專家共識中ACO的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；(2)哮喘急性發(fā)作期患者符合《支氣管哮喘防治指南》[8]中哮喘的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(3)COPD急性加重期患者符合《慢性阻塞性肺疾病診治指南》[9]中COPD的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(4)健康體檢者各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室生化指標(biāo)均正常；(5)受試者年齡18～80歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)胸部影像學(xué)表現(xiàn)明顯異常；(2)近3個月有吸煙、酗酒史；(3)48 h內(nèi)使用過支氣管擴(kuò)張劑、激素類藥物；(4)有惡性腫瘤病史；(5)存在先天性免疫功能缺陷；(6)伴有心臟、肝臟、腎臟等重要臟器功能不全；(7)合并其他呼吸道疾病者。該研究已獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，入組對象及家屬均自愿簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器 抗CD4、CD25流式抗體，購自IMMUNOSTEP公司；ELISA檢測試劑盒，購自Cygnus Technologies股份有限公司；FCM，來自常州必達(dá)科生物科技有限公司；NIOX NO測定儀，來自Aerocrine AB公司；肺功能儀，來自德國耶格公司。

1.2.2 樣本采集及細(xì)胞分離 分別采集入組對象外周靜脈血5 mL，抗凝處理后600×g離心10 min，分離血漿并于-80 ℃保存。采用Ficoll密度梯度離心法分離樣本PBMC，調(diào)整密度至2×106個/mL，重懸于RPMI 1640培養(yǎng)液中。

1.2.3 FACS檢測受試者外周血Treg、Th17百分比 將制備的PBMC加入24孔板，加入佛波酯和離子霉素，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。收集細(xì)胞并分為同型對照組和實(shí)驗(yàn)組，分別加入抗CD4、CD25抗體，避光孵育30 min；漂洗后加入Fix/Perm液固定、穿膜；分別加入抗Foxp3、IL-17和同型對照抗體，室溫避光孵育1 h；漂洗樣本后重懸，F(xiàn)CM檢測Treg、Th17百分比。

1.2.4 ELISA檢測受試者外周血IL-17、IL-23、IL-6

和TGF-β水平 取凍存血漿，復(fù)溫，按照試劑盒說明書檢測其IL-17、IL-23、IL-6及TGF-β水平。

1.2.5 FeNO的檢測 肺功能檢測之前進(jìn)行患者呼出氣一氧化氮(fractional exhaled nitric oxide, FeNO)的檢測。

1.2.6 肺功能的檢測 應(yīng)用Medisoft型肺功能儀測定患者肺功能，主要檢測指標(biāo)為第1秒用力呼氣容積(forced expiratory volume in one second， FEV1)/用力肺活量(forced vital capacity， FVC)百分比和第1秒用力呼氣容積占預(yù)計值百分比(FEV1 in predicted, FEV1%pred)。

2 結(jié)果

2.1 各組一般資料的比較4組受試者在性別組成、年齡、BMI、吸煙史和易感體質(zhì)比例等方面比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性(表1)。

表1 各組一般資料的比較

2.2 各組外周血Treg、Th17百分比的比較各組外周血Treg、Th17百分比及Treg/Th17比值比較示差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.001)。ACO組、哮喘組及COPD組Treg百分比、Treg/Th17比值顯著低于健康組，Th17百分比顯著高于健康組(均P<0.05)；其中ACO組Treg百分比、Treg/Th17比值顯著低于哮喘組和COPD組，Th17百分比顯著高于哮喘組和COPD組(均P<0.05)。(表2、圖1)

表2 各組外周血Treg、Th17百分比比較

2.3 各組血漿IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β水平的比較各組血漿IL-17、IL-6、IL-23、TGF-β水平的比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.001)。ACO組、哮喘組及COPD組IL-17、IL-23、IL-6和TGF-β水平顯著高于健康組(均P<0.05)，其中ACO組IL-17、IL-23、IL-6及TGF-β水平顯著高于哮喘組和COPD組(均P<0.05)。(表3)

表3 各組血漿IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β水平比較

2.4 各組FeNO和肺功能指標(biāo)的比較各組FeNO、FEV1/FVC百分比和FEV1%pred的比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.001)。ACO組、哮喘組和COPD組FeNO顯著高于健康組，F(xiàn)EV1/FVC、FEV1%pred顯著低于健康組(均P<0.05)；其中ACO組、哮喘組FeNO顯著高于COPD組(均P<0.05)，但ACO組FeNO與哮喘組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；ACO組、COPD組FEV1/FVC、FEV1%pred顯著低于哮喘組(均P<0.05)，但ACO組與COPD組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。(表4)

表4 各組FeNO和肺功能指標(biāo)的比較

2.5 Treg/Th17比值的ROC分析采用ROC分析Treg/Th17比值的診斷效能。結(jié)果顯示，Treg/Th17對ACO組、COPD組、哮喘組及健康組有一定鑒別能力，其中鑒別ACO組與哮喘組、ACO組與健康組、COPD組與哮喘組、COPD組與健康組的AUC均大于0.850。而鑒別ACO組與COPD組、哮喘組與健康組的能力一般，前者AUC為0.726，敏感度、特異度分別為48.1%、95.6%；后者AUC為0.771，敏感度、特異度分別為88.3%、73.3%。(圖2、表5)

圖2 Treg/Th17比值的ROC分析

表5 Treg/Th17對ACO、哮喘和COPD的診斷及鑒別診斷效能評估

3 討論

目前，臨床上對ACO尚無明確統(tǒng)一的診斷標(biāo)準(zhǔn)，醫(yī)生必須詳細(xì)詢問患者病史，反復(fù)進(jìn)行肺功能、實(shí)驗(yàn)室及其他輔助檢查，作出綜合判斷，但極易出現(xiàn)誤診、漏診[10]。氣道炎癥是ACO發(fā)生發(fā)展的主要因素之一，而由嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞共同介導(dǎo)的氣道炎癥可能是ACO的重要發(fā)病機(jī)制[11]。

Th17和Treg均屬于CD4+T細(xì)胞亞群，其在免疫炎癥反應(yīng)中有重要調(diào)控作用，這2種細(xì)胞的功能相互拮抗，其細(xì)胞比例失衡是多種炎癥性疾病和自身免疫性疾病發(fā)生的主要因素[12]。Huang等[13]研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，哮喘患兒存在明顯的Treg/Th17失衡，且與疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。Sun等[14]研究指出，Treg/Th17失衡在COPD的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。該研究結(jié)果顯示，ACO患者Treg/Th17比值顯著低于COPD、哮喘患者和健康者，提示ACO患者Treg/Th17失衡最為嚴(yán)重，可能機(jī)制是Treg、Th17的分化紊亂加劇了體內(nèi)炎癥細(xì)胞激活及炎性因子分泌，加重氣道炎癥反應(yīng)。

IL-17是Th17的主要效應(yīng)因子，可激活T細(xì)胞并刺激上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等產(chǎn)生多種細(xì)胞因子如IL-6、IL-8等，放大炎癥反應(yīng)[15]。IL-6和TGF-β是Th分化中的關(guān)鍵因子，在兩者的協(xié)同刺激下，活化的Th分化為Th17[16]。IL-23雖不參與Th17分化，但對于維持Th17的存活和增殖有重要作用[17]。Sarinho等[18]觀察到IL-6、IL-17水平在慢性持續(xù)性哮喘患兒中明顯升高，且與患兒疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)。曾文等[19]研究發(fā)現(xiàn)，COPD患者外周血IL-22、IL-23、IL-12等細(xì)胞因子水平較健康人群升高；疾病狀態(tài)下，Treg/Th17平衡被打破；肺功能指標(biāo)FEV1與Th17水平呈負(fù)相關(guān)，與Treg水平呈正相關(guān)。該研究發(fā)現(xiàn)，ACO患者IL-17、IL-23、IL-6及TGF-β水平顯著高于COPD患者、哮喘患者和健康者，進(jìn)一步驗(yàn)證了Treg/Th17失衡引起的免疫平衡紊亂可能是ACO病理生理機(jī)制之一。此外，ACO組、哮喘組FeNO水平顯著高于COPD組，而FEV1/FVC百分比、FEV1%pred顯著低于哮喘組。上述結(jié)果表明，ACO患者病情更重，氣道炎癥反應(yīng)水平更高，這可能是ACO患者兼具喘息癥狀反復(fù)發(fā)作和COPD氣流受限等臨床表現(xiàn)的原因，與史菲[20]的研究結(jié)果相似。ACO的氣道炎癥表現(xiàn)與COPD相似，但該研究結(jié)果提示ACO氣道炎癥反應(yīng)水平高于COPD，可能還與中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等的作用有關(guān)，后續(xù)還有待深入分析。另外，ROC分析提示，Treg/Th17對于ACO、COPD、哮喘患者及健康者具有一定的鑒別能力，其中對ACO與哮喘者、ACO與健康者、COPD與哮喘者、COPD與健康者的診斷價值較高，但對ACO與COPD者、哮喘者與健康者的鑒別能力一般。然而，研究收集的病例數(shù)較少，可能存在樣本偏倚，后續(xù)將募集更多ACO、哮喘及COPD患者，檢測其外周血Treg、Th17水平，進(jìn)一步分析它們的診斷價值。

綜上所述，ACO患者存在明顯的Treg/Th17失衡，外周血Treg、Th17檢測可能有助于ACO、哮喘及COPD的鑒別，初步為ACO的診斷提供參考，后續(xù)還需要大樣本數(shù)據(jù)深入驗(yàn)證。