MALAT1通過調控miR-146a減輕關節軟骨細胞凋亡和基質降解的研究

宋超，王冶，蒲勁松，陳林，郭浩然，崔瀚文

(川北醫學院附屬醫院 骨科，南充 637000)

骨關節炎(osteoarthritis，OA)是一種慢性退行性關節疾病，關節軟骨降解、軟骨下骨硬化、滑膜炎以及骨贅形成是OA常見的病理特征。OA頻繁地發生于老齡人群中，可導致患者關節疼痛、功能失調、殘疾[1-2]。盡管如今已發展出諸如藥物治療、針灸療法、電磁治療、干細胞療法等治療方式，但OA依然難以徹底治愈[3-4]。轉移相關肺腺癌轉錄本1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)最早發現于與非小細胞肺癌患者生存相關的轉錄產物篩選，研究發現其與許多人類疾病有著密切關系[5]。Liang等[6]研究發現，MALAT1/miR-127-5p可調控骨橋素介導的軟骨細胞增殖，從而對OA起調控作用。盡管有文獻報道在急性腎損傷中MALAT1與miR-146a存在相互作用[7]，但MALAT1和miR-146a是否參與了對OA的調控尚未見報道。本研究通過培養人軟骨細胞株CHON-001，并經過miR-146a或MALAT1重組過表達載體轉染以及IL-1β處理，探究MALAT1/miR-146a對軟骨細胞凋亡及細胞外基質降解的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床樣本獲取 從川北醫學院附屬醫院接受了全膝關節置換手術的OA患者身上獲取OA關節軟骨組織20例，從接受了截肢手術的非OA患者身上獲取普通關節軟骨組織20例，所有軟骨組織的獲取均遵照中國骨科學會骨關節炎研究醫學會的診斷標準，組織樣本經手術摘取后立即通過液氮速凍保存。本研究得到了醫院倫理委員會的支持以及患者本人的知情同意。

1.1.2 主要試劑 DMEM培養液、FCS購自美國Gibco公司，IL-1β購自美國Sigma公司，CCK-8試劑盒、Hoechst試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司，反轉錄試劑盒、雙熒光素酶報告基因檢測系統購自美國Promega公司，SYBR GreenMix試劑盒購自日本TaKaRa公司，miR-146a、mimics NC及pcDNA 3.0-MALAT1重組過表達載體由上海吉瑪制藥技術有限公司合成，活化型半胱天冬酶3(cleaved caspase 3，cl-CASP3)、B細胞淋巴瘤因子2(B-cell lymphoma 2，Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)、基質金屬蛋白酶13(matrix metalloproteinase 13，MMP-13)、帶有血小板凝血酶敏感蛋白結構域的解聚素金屬蛋白酶5(A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 5，ADAMTS-5)、Ⅱ型膠原蛋白(collagen Ⅱ，COL2)、聚蛋白聚糖、β-actin一抗及辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記的二抗購自英國Abcam公司，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人關節軟骨細胞株CHON-001購自美國ATCC，采用含0.1 mg/L G-418和10%FCS的DMEM培養液在5%CO237 ℃環境中培養。

1.2.2 細胞分組及處理方法 將細胞分為空白對照組、IL-1β組、陰性對照(negetive control，NC)組、miR-146a組、MALAT1組以及miR-146a+MALAT1組，按照Lipofectamine 2000試劑的操作說明，NC組轉染mimics NC，miR-146a組轉染miR-146a mimics，MALAT1組轉染pcDNA3.0-MALAT1重組過表達載體，miR-146a+MALAT1組共轉染miR-146a和MALAT1過表達載體，在48 h的轉染后，除空白對照組外，其余各組均使用10 ng/mL的IL-1β處理細胞，24 h后進行檢測。

1.2.3 RT-PCR檢測基因表達 通過TRIzol試劑提取各組細胞總RNA，按照反轉錄試劑盒提供的方法反轉錄合成cDNA，根據SYBR GreenMix試劑盒提供的方法進行RT-PCR，循環條件為：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性5 s，60 ℃退火10 s，反應進行40個循環。采用2-ΔΔCt法計算基因表達水平。

1.2.4 雙熒光素酶報告基因試驗檢測靶向作用關系 構建MALAT1的pGL3 luciferase promoter野生型(WT)和突變型(MUT)載體，將重組載體分別與miR-146a mimics或mimics NC共轉染HEK293T細胞，轉染24 h后采用雙熒光素酶報告基因檢測系統檢測熒光素酶活性。

1.2.5 CCK-8檢測細胞增殖水平 在常規條件下培養各組細胞，每24 h取1次樣，采用CCK-8試劑檢測細胞光密度[D(450 nm)]，共檢測3 d。將取樣的細胞接種于96孔板中，每孔加入10 μL CCK-8試劑，4 h后用酶標儀檢測D(450 nm)，通過標準曲線計算各時間點細胞增殖的倍數。

1.2.6 Hoechst檢測細胞凋亡水平 將各組細胞接種于6孔板中，使用4%多聚甲醛固定細胞30 min，0.5% TrintonX-100透膜處理，Hoechst熒光染料進行30 min染色。在熒光顯微鏡下觀察細胞的凋亡情況，將細胞核固縮、核致密濃染及碎片化致密濃染的細胞視為凋亡細胞。細胞凋亡率計算公式為：細胞凋亡率 = 凋亡細胞/細胞總數 × 100%。

1.2.7 Western blotting檢測蛋白表達 用RIPA裂解液對各組細胞總蛋白進行提取，用BCA蛋白定量試劑盒對各組總蛋白濃度進行檢測，每組取30 μg蛋白進行點樣，用10%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離，半干轉膜法轉移蛋白至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，5%牛血清白蛋白4 ℃封閉2 h，加入對應一抗4 ℃孵育過夜， TBST緩沖液洗3次，用HRP標記的二抗室溫孵育1 h，電化學發光(electrochemiluminescence，ECL)顯色液顯影，用凝膠成像系統掃描灰度分析蛋白質的相對表達水平。

2 結果

2.1 OA關節軟骨組織MALAT1與miR-146a表達的相關性對OA關節軟骨組織和普通關節軟骨組織MALAT1和miR-146a的相對表達水平進行檢測。結果顯示，OA關節軟骨組織MALAT1的相對表達水平較普通關節軟骨組織顯著升高(P<0.05)，miR-146a的相對表達水平顯著降低(P<0.05)。OA關節軟骨組織MALAT1與miR-146a的相對表達水平呈負相關(r=-0.907 8，P<0.001)。(圖1)

注：A.RT-PCR檢測關節軟骨組織中MALAT1表達；B.RT-PCR檢測關節軟骨組織中miR-146a表達；C.Spearman法分析MALAT1與miR-146a表達的相關性。*P<0.05。圖1 臨床關節軟骨組織中MALAT1和miR-146a的相對表達水平及其相關性

2.2 miR-146a和MALAT1的相互作用關系對CHON-001細胞中miR-146a和MALAT1的表達進行檢測。結果顯示，與空白對照組細胞比較，在IL-1β組細胞miR-146a的相對表達水平顯著降低(P<0.01)，MALAT1的相對表達水平顯著升高(P<0.01)。進一步對miR-146a和MALAT1的靶向關系進行驗證，結果顯示，在MALAT1-WT組中，與經過mimics NC處理的細胞比較，經過miR-146a mimics處理的細胞其相對熒光素酶活性顯著降低(P<0.01)；在MALAT1-MUT組中，經過mimics NC處理的細胞與經過miR-146a mimics處理的細胞比較，相對熒光素酶活性差異無統計學意義(P>0.05)。(圖2)

注：A.RT-PCR檢測CHON-001細胞中miR-146a和MALAT1的表達；B.雙熒光素酶報告基因試驗檢測miR-146a和MALAT1的靶向作用關系。n=6；與空白對照組比較，**P<0.01；與mimics NC比較，##P<0.01。圖2 miR-146a與MALAT1相互作用關系的驗證

2.3 MALAT1對miR-146a表達的影響CHON-001細胞轉染mimics NC、miR-146a mimics或pcDNA3.0-MALAT1后，對細胞miR-146a的表達水平進行檢測。與空白對照組比較，IL-1β組細胞miR-146a的相對表達水平顯著降低(P<0.01)；與IL-1β組比較，NC組細胞miR-146a的相對表達水平差異無統計學意義(P>0.05)，miR-146a組細胞miR-146a的相對表達水平顯著升高(P<0.001)，MALAT1組細胞miR-146a的相對表達水平顯著降低(P<0.01)；與miR-146a組比較，miR-146a+MALAT1組細胞miR-146a的相對表達水平顯著降低(P<0.01)。(圖3)

注：n=6；與空白對照組比較，**P<0.01；與IL-1β組比較，##P<0.01，###P<0.001；與miR-146a組比較，△△P<0.01。圖3 RT-PCR檢測MALAT1對miR-146a相對表達水平的影響

2.4 miR-146a和MALAT1對關節軟骨細胞增殖的影響對CHON-001細胞增殖水平進行檢測。結果顯示，與空白對照組比較，IL-1β組細胞增殖倍數顯著降低(P<0.01)；與IL-1β組比較，NC組細胞增殖倍數差異無統計學意義(P>0.05)，miR-146a組細胞增殖倍數顯著降低(P<0.01)，MALAT1組細胞增值倍數顯著升高(P<0.01)；與miR-146a組比較，miR-146a+MALAT1組細胞增殖倍數顯著升高(P<0.01)。(圖4)

2.5 miR-146a和MALAT1對關節軟骨細胞凋亡的影響對CHON-001細胞凋亡水平進行檢測。結果顯示，與空白對照組比較，IL-1β組細胞凋亡率顯著升高(P<0.01)；與IL-1β組比較，NC組細胞凋亡率差異無統計學意義(P>0.05)，miR-146a組細胞凋亡率顯著升高(P<0.01)，MALAT1組細胞凋亡率顯著降低(P<0.01)；與miR-146a組比較，miR-146a+MALAT1組細胞凋亡率顯著降低(P<0.01)。(圖5)

注：n=6；與空白對照組比較，**P<0.01；與IL-1β組比較，##P<0.01；與miR-146a組比較，△△P<0.01。圖4 CCK-8檢測miR-146a和MALAT1對CHON-001細胞增殖的影響

2.6 miR-146a和MALAT1對關節軟骨細胞凋亡標志蛋白表達的影響對CHON-001細胞凋亡標志蛋白表達水平進行檢測。結果顯示，與空白對照組比較，IL-1β組細胞cl-CASP3和Bax相對蛋白表達水平顯著升高(P<0.01)，Bcl-2相對蛋白表達水平顯著降低(P<0.01)；與IL-1β組比較，NC組細胞cl-CASP3、Bax和Bcl-2相對蛋白表達水平差異無統計學意義(P>0.05)，miR-146a組細胞cl-CASP3和Bax相對蛋白表達水平顯著升高(P<0.01)，Bcl-2相對蛋白表達水平顯著降低(P<0.01)，MALAT1組細胞cl-CASP3和Bax相對蛋白表達水平顯著降低(P<0.01)，Bcl-2相對蛋白表達水平顯著升高(P<0.01)；與miR-146a組比較，miR-146a+MALAT1組細胞cl-CASP3和Bax相對蛋白表達水平顯著降低(P<0.01)，Bcl-2相對蛋白表達水平顯著升高(P<0.01)。(圖6)

注：A.Hoechst檢測細胞凋亡形態；B.miR-146a和MALAT1對細胞凋亡的影響。n=6；與空白對照組比較，**P<0.01；與IL-1β組比較，##P<0.01；與miR-146a組比較，△△P<0.01。圖5 Hoechst檢測miR-146a和MALAT1對CHON-001細胞凋亡的影響

注：A.Western blotting檢測細胞凋亡標志蛋白的表達；B.miR-146a和MALAT1對細胞凋亡標志蛋白表達的影響。n=6；與空白對照組比較，**P<0.01；與IL-1β組比較，##P<0.01；與miR-146a組比較，△△P<0.01。圖6 Western blotting檢測miR-146a和MALAT1對CHON-001細胞凋亡標志蛋白表達的影響

2.7 miR-146a和MALAT1對細胞外基質降解的影響對CHON-001細胞的細胞外基質相關蛋白的表達進行檢測。結果顯示，與空白對照組比較，IL-1β組細胞MMP-13和ADAMTS-5相對蛋白表達水平顯著升高(P<0.01)，COL2和聚蛋白聚糖相對蛋白表達水平顯著降低(P<0.01)；與IL-1β組比較，NC組細胞MMP-13、ADAMTS-5、COL2和聚蛋白聚糖相對蛋白表達水平差異無統計學意義(P>0.05)，miR-146a組細胞MMP-13和ADAMTS-5相對蛋白表達水平顯著升高(P<0.01)，COL2和聚蛋白聚糖相對蛋白表達水平顯著降低(P<0.01)，MALAT1組細胞MMP-13和ADAMTS-5相對蛋白表達水平顯著降低(P<0.01)，COL2和聚蛋白聚糖相對蛋白表達水平顯著升高(P<0.01)；與miR-146a組比較，miR-146a+MALAT1組細胞MMP-13和ADAMTS-5相對蛋白表達水平顯著降低(P<0.01)，COL2和聚蛋白聚糖相對蛋白表達水平顯著升高(P<0.01)。(圖7)

注：A.Western blotting檢測細胞外基質相關蛋白的表達；B.miR-146a和MALAT1對細胞外基質相關蛋白表達的影響。n=6；與空白對照組比較，**P<0.01；與IL-1β組比較，##P<0.01；與miR-146a組比較，△△P<0.01。圖7 Western blotting檢測miR-146a和MALAT1對CHON-001細胞的細胞外基質相關蛋白表達的影響

3 討論

軟骨細胞是關節軟骨構成中唯一的一種細胞類型，被包裹在由自身合成的細胞外基質中。盡管這種細胞僅占關節軟骨組織1%的體積，但其在維持基質的組成和完整性上是不可缺少的。在OA發病時可觀察到進行性軟骨退化病變，同時可觀察到空骨陷窩形成以及軟骨細胞缺少，表明軟骨細胞死亡與OA的發生、發展有著密切聯系[8-9]。研究發現，MALAT1可通過miRNA分子海綿作用競爭性結合miR-127-5p，參與對軟骨細胞增殖的調控[6]。miR-146a在Li等[10]的研究中被報道參與了軟骨細胞凋亡的調控，而MALAT1是否可通過與miR-146a靶向作用參與對軟骨細胞的調控尚未見報道。本研究對臨床OA樣本中MALAT1和miR-146a的表達進行檢測，發現OA樣本中MALAT1表達水平升高，同時miR-146a表達水平下降，兩者的變化呈明顯的負相關趨勢。體外培養的軟骨細胞經過IL-1β處理后，miR-146a和MALAT1表達水平的變化與臨床樣本一致。雙熒光素酶報告基因試驗顯示，miR-146a與MALAT1具有靶向作用關系。本研究結果表明，MALAT1在軟骨組織及細胞中表達水平升高，并可靶向抑制miR-146a的表達。

為了進一步探究MALAT1和miR-146a的相互作用對軟骨細胞增殖、凋亡可能存在的影響，本研究用miR-146a mimics或MALAT1過表達載體轉染了經IL-1β處理的軟骨細胞，發現MALAT1過表達可顯著降低細胞中miR-146a的表達水平。同時miR-146a過表達顯著抑制了細胞增殖，并促進細胞凋亡，而MALAT1過表達可扭轉miR-146a對細胞增殖和凋亡的作用。此外本研究發現，miR-146a過表達顯著提升了cl-CASP3和Bax蛋白水平，同時降低Bcl-2蛋白水平。cl-CASP3是細胞凋亡過程中的主要效應因子，而抗凋亡基因Bcl-2可與促凋亡基因Bax形成二聚體從而抑制凋亡的發生，三者常被用作檢測細胞凋亡的分子標志物[11-13]。上述結果表明，MALAT1靶向抑制miR-146a表達可促進OA軟骨細胞恢復增殖，并抑制其凋亡。

細胞外基質降解是OA病理變化過程中的一個重要機制，隨著疾病進展，聚蛋白聚糖顯著減少，同時COL2在OA變性區域水平降低，而ADAMTS-5和MMP-13分別是降解COL2和聚蛋白聚糖的主要酶，在OA軟骨病變的初期，其表達量就會上調[14-16]。本研究發現，在IL-1β處理的軟骨細胞中，miR-146a過表達可顯著上調MMP-13和ADAMTS-5的表達，并下調COL2和聚蛋白聚糖的表達，而MALAT1過表達可扭轉miR-146a對這些蛋白的調控，提示miR-146a可提高細胞外基質降解水平，MALAT1可通過靶向抑制miR-146a表達來抑制OA軟骨細胞的細胞外基質降解。

綜上所述，MALAT1可與miR-146a發生靶向作用，抑制OA軟骨細胞內miR-146a表達，進而促進軟骨細胞恢復增殖，抑制凋亡，并阻止軟骨細胞的細胞外基質降解。本研究探究了MALAT1通過競爭性結合miR-146a對軟骨細胞增殖和凋亡的調控作用，為OA的治療提供了新的思路。本研究還存在不足之處，后期計劃對miR-146a下游靶向調控基因進行進一步探究，并通過動物實驗對MALAT1及miR-146a的作用機制進行驗證。