紫杉醇聯合他莫昔芬對人乳腺癌細胞MCF-7的作用

姜曉曄，姜婷婷，李冉，王璇，孫世猷，程序

(1.武漢城市學院 醫學部，武漢 430083；2.武漢市第四醫院 心血管內二科，武漢 430000；3.燕山大學 校醫院，秦皇島 066000)

乳腺癌是最常見的女性惡性腫瘤之一，發病率約占各類惡性腫瘤的7%，抗雌激素藥物他莫昔芬是預防乳腺癌復發和擴散的一線藥物[1]。然而，患者對他莫昔芬的耐藥限制了其使用，大約50%長期使用他莫昔芬的乳腺癌患者產生繼發性耐藥[2-4]。聯合用藥可減少他莫昔芬藥量，降低繼發性耐藥率，同時增加乳腺癌細胞對藥物的敏感性[5-6]。研究證實，他莫昔芬與抗腫瘤成分白藜蘆醇聯合使用可明顯抑制乳腺癌MCF-7細胞增殖并增加腫瘤細胞對他莫昔芬的敏感性[7]。

紫杉醇也是重要的天然抗腫瘤成分之一，通過抑制微管蛋白解聚將腫瘤細胞的細胞周期阻滯于G2/M期，最終導致其凋亡[8]。紫杉醇聯合他莫昔芬對MCF-7細胞的作用及其機制還有待進一步探究。該研究探索這2種藥物是否具有抗MCF-7細胞的協同效應，以期為兩者聯合應用提供一定理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑人乳腺癌細胞MCF-7，購自上海谷研實業有限公司；RPMI 1640 培養液、FCS和胰蛋白酶，購自Gibco公司；MTT試劑，購自Biosharp公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)，購自上海碧云天生物技術有限公司；Anne-xin Ⅴ-FITC/PI流式凋亡試劑盒，購自BD公司；兔抗人β-actin多克隆抗體、增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)多克隆抗體、Bcl-2多克隆抗體、Bax多克隆抗體和山羊抗兔IgG二抗，購自CST公司；0.22 μm PVDF膜，購自Biosharp公司；青霉素-鏈霉素溶液、Hoechst 33258染色液、DMSO、雙染蛋白marker和顯影液，購自生工生物工程(上海)股份有限公司；紫杉醇注射液，購自揚子江藥業集團有限公司；他莫昔芬片劑，購自阿斯利康投資(中國)有限公司；CCL22、IL-10、TGF-β1 ELISA檢測試劑盒，購自北京百奧萊博科技有限公司。

1.2 主要儀器化學發光成像儀、Western blotting電泳儀、垂直電泳槽和轉移電泳槽(Bio-Rad公司)；全自動酶標儀(美國伯騰儀器有限公司)；FACScan流式細胞儀(BD公司)；倒置熒光顯微鏡IX73[奧林巴斯(中國)有限公司]；CT14RD高速冷凍離心機(上海天美科學儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 細胞的培養 將人乳腺癌細胞MCF-7置于含10% FCS、1%青霉素-鏈霉素的RPMI1640培養液中，于37 ℃、5% CO2培養箱中常規培養。

1.3.2 紫杉醇、他莫昔芬單藥對腫瘤細胞增殖的影響 用0.25%胰蛋白酶消化對數生長期MCF-7細胞，以2 000 個/孔密度接種于96孔板，細胞貼壁后分別加入單藥，總體積200 μL/孔。紫杉醇組按濃度梯度分為2、5、10、25和50 ng/mL處理組，他莫昔芬組則分為6.25、12.5、25、50和100 μg/mL處理組，對照組加入等量的培養液。每個處理濃度設3個復孔，24 h后進行MTT檢測。

每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，孵育4 h后棄上清液，加入150 μL DMSO振蕩15 min，檢測光密度D(490 nm)值并計算細胞增殖抑制率。用GraphPad Prism 6軟件計算2組MCF-7細胞24 h的半數抑制濃度(inhibitory concentration 50， IC50)。對于后續的細胞凋亡實驗、Western blotting及ELISA檢測均以他莫昔芬和紫杉醇IC50為用藥濃度。

增殖抑制率=[1-(D給藥后-D給藥前)/(D對照組-D對照本底)]×100%

1.3.3 紫杉醇與他莫昔芬聯合用藥對腫瘤細胞增殖的影響 用0.25%胰蛋白酶消化對數生長期MCF-7細胞，以2 000 個/孔密度接種于96孔板，細胞貼壁后加入藥物，使總體積為200 μL/孔。加入紫杉醇與他莫昔芬共同作用24 h，聯合用藥藥物濃度的選擇見參考文獻[9]，終濃度為紫杉醇IC50×1/8+他莫昔芬IC50×1/8，紫杉醇IC50×1/4+他莫昔芬IC50×1/4，紫杉醇IC50×1/2+他莫昔芬IC50×1/2，紫杉醇IC50×1+他莫昔芬IC50×1，紫杉醇IC50×2+他莫昔芬IC50×2。通過Chou-Talalay中效方程式為基礎設計的軟件CompuSyn完成統計分析。聯合指數(combination index，CI)>1提示藥物間為拮抗作用，CI=1示藥物間為相加作用，CI<1示藥物間為協同作用。

1.3.4 熒光顯微鏡下觀察腫瘤細胞凋亡情況 MCF-7細胞完全貼壁后分別加入3組藥物(紫杉醇、他莫昔芬和紫杉醇聯合他莫昔芬),對照組加入等量的培養液。作用24 h后，收集各組約106個細胞，用預冷PBS漂洗2次。4%甲醛4 ℃固定細胞10 min后涂片，晾干。用5 mg/L Hoechst 33258染色液作用5～10 min，濾紙吸凈多余液體。熒光顯微鏡下觀察染色細胞并攝片。

1.3.5 FACS檢測腫瘤細胞凋亡和細胞周期分布 收集各組細胞5×104個/組，分別按細胞凋亡(PI、Annexin Ⅴ-FITC雙染)和細胞周期(PI單染)試劑盒說明書操作，FACS檢測細胞凋亡和細胞周期分布情況。

1.3.6 ELISA檢測腫瘤細胞細胞因子的分泌 3組藥物作用細胞24 h后，取各組上清液按照ELISA說明書檢測CCL22、IL-10、TGF-β1表達，根據標準曲線讀取各組濃度。

1.3.7 Western blotting檢測腫瘤細胞凋亡相關蛋白的表達 超聲振蕩10～15 s裂解各組細胞，分別提取總蛋白。各取20 μL上清液，95～100 ℃熱處理5 min；置冰上冷卻后離心5 min，SDS-PAGE，轉膜；5%脫脂牛奶封閉，加入一抗(抗β-actin、PCNA、Bcl-2、Bax，1∶1 000稀釋)4 ℃過夜孵育，再加入山羊抗兔IgG二抗(1∶10 000稀釋)室溫孵育1 h；ECL曝光成像，化學發光成像儀分析結果。

2 結果

2.1 紫杉醇及他莫昔芬單藥和聯合用藥對MCF-7細胞的增殖抑制作用MCF-7細胞在紫杉醇組、他莫昔芬組用藥24 h后的IC50分別為11.38 ng/mL和30.87 μg/mL。單用兩藥對MCF-7細胞增殖的抑制作用隨著藥物濃度的增加而增強，具有濃度依賴性(圖1)。相較于單藥組，兩藥聯合作用對腫瘤細胞增殖的抑制增加顯著(均P<0.05，圖2)。CompuSyn軟件分析顯示兩藥聯合時，CI=0.79，呈協同作用。Western blotting檢測結果顯示，紫杉醇+他莫昔芬組相較于單藥組PCNA表達水平明顯降低(圖3)。

注：與紫杉醇和他莫昔芬聯合組相比，*P<0.05。圖2 各用藥組對MCF-7細胞的體外抑制作用

圖3 紫杉醇與他莫昔芬聯合用藥對MCF-7細胞PCNA表達的影響

2.2 熒光顯微鏡下觀察腫瘤細胞凋亡情況3組藥物作用于MCF-7細胞24 h后，與對照組比較，各給藥組凋亡細胞數增多，且紫杉醇+他莫昔芬組較紫杉醇組、他莫昔芬組凋亡細胞數增多(圖4)。

2.3 紫杉醇及他莫昔芬單藥和聯合用藥對MCF-7細胞凋亡和細胞周期的影響紫杉醇及他莫昔芬按IC50作用于MCF-7細胞24 h后，經Annexin Ⅴ-FITC/PI流式凋亡試劑盒染色觀察到各組細胞凋亡率不同，對照組、紫杉醇組、他莫昔芬組及紫杉醇+他莫昔芬組凋亡率分別為(5.56±0.12)%、(15.51±2.34)%、(18.82±3.21)%和(25.24±2.28)%。紫杉醇+他莫昔芬組較單藥組細胞凋亡明顯增多(圖5)。細胞周期分析顯示，紫杉醇阻滯(50.18±1.56)%細胞于G0/G1期，他莫昔芬阻滯(49.26±2.17)%細胞于G0/G1期，而紫杉醇+他莫昔芬組阻滯(75.29±2.48)%細胞于G0/G1期，提示聯合用藥產生協同作用阻滯細胞周期于G0/G1期，抑制細胞增殖(圖6)。

注：白色箭頭表示凋亡細胞。圖4 紫杉醇及他莫昔芬單藥和聯合用藥對MCF-7細胞凋亡的影響(×200)

圖5 紫杉醇和他莫昔芬單藥及聯合用藥對MCF-7細胞凋亡的影響

注：A. 各處理組MCF-7細胞細胞周期百分比； B. 各處理組MCF-7細胞細胞周期百分比定量結果。圖6 紫杉醇及他莫昔芬單藥和聯合用藥對MCF-7細胞細胞周期的影響

2.4 紫杉醇及他莫昔芬單藥和聯合用藥對MCF-7細胞Bcl-2、Bax表達的影響Western blotting檢測結果顯示，與對照組相比，他莫昔芬組、紫杉醇組和紫杉醇+他莫昔芬組細胞培養上清液中Bcl-2蛋白表達水平明顯下降，Bax表達水平明顯升高，其中聯合用藥組相較于單藥組變化更明顯(圖7)。

2.5 紫杉醇及他莫昔芬單藥和聯合用藥對MCF-7細胞CCL22、IL-10、TGF-β1表達的影響ELISA檢測結果顯示，與對照組相比，他莫昔芬組、紫杉醇組和紫杉醇+他莫昔芬組細胞培養上清液中CCL22、IL-10、TGF-β1表達量均顯著下降，聯合用藥組顯著低于單藥組(均P<0.05，表1)。

圖7 紫杉醇及他莫昔芬單藥和聯合用藥對MCF-7細胞Bcl-2、Bax蛋白表達的影響

表1 紫杉醇及他莫昔芬單藥和聯合用藥對MCF-7細胞CCL22、IL-10、TGF-β1表達的影響

3 討論

我國乳腺癌發病率居女性腫瘤首位，其轉移與復發也是導致乳腺癌患者死亡的主要原因。服用他莫昔芬可使有乳腺癌家族史的女性罹患風險降低30%以上，并且也可有效降低患者的復發死亡風險[10]。因此，他莫昔芬已成為臨床上預防和治療乳腺癌的首選藥物。然而，約50%長期使用他莫昔芬的乳腺癌患者產生繼發性耐藥。他莫昔芬的主要作用機制為與雌激素競爭性結合ER，阻斷雌激素作用于乳腺癌細胞的信號通路，抑制ER陽性乳腺癌細胞增殖。而紫杉醇對多種腫瘤存在抑制作用，現已廣泛應用于臨床，成為腫瘤化療藥物的首選。

MTT檢測結果表明，他莫昔芬與紫杉醇單藥處理MCF-7細胞都可抑制其增殖，其PCNA蛋白表達量明顯減少。紫杉醇和他莫昔芬作用24 h后的IC50分別為11.38 ng/mL和30.87 μg/mL，兩藥聯合作用時CI<1，呈協同作用。可能的原因為：紫杉醇促進微管蛋白聚合形成微管，同時抑制已形成的微管解聚，從而抑制細胞分裂增殖，不僅限于抑制ER陽性乳腺癌細胞[8]；聯合用藥可打破他莫昔芬只抑制ER陽性乳腺癌細胞增殖的局限，增加其療效。

研究結果表明，他莫昔芬與紫杉醇單藥都可誘導MCF-7細胞凋亡，可能機制是降低了乳腺癌細胞中凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達，上調了促凋亡蛋白Bax的表達，從而下調了Bcl-2/Bax比值，促使腫瘤細胞凋亡[11]。這與金偉[12]和高菲菲[13]的研究結果一致。他莫昔芬與紫杉醇聯合用藥時MCF-7細胞凋亡率可達(25.24±2.28)%，且與單藥比較Bax表達明顯上升、Bcl-2表達明顯下降。這表明他莫昔芬與紫杉醇發揮協同抗腫瘤作用的重要機制是誘導細胞凋亡。

近年來，人們越來越認識到腫瘤細胞的免疫逃逸在疾病發生、發展過程中發揮重要作用[14-15]。已有研究表明，腫瘤細胞通過分泌免疫調節因子IL-10和TGF-β1影響機體的免疫應答水平，促進腫瘤細胞免疫逃逸[16-18]。盡管腫瘤相關巨噬細胞是腫瘤微環境中IL-10的主要來源，但乳腺癌MCF-7細胞也可產生IL-10降低機體抗腫瘤免疫應答水平，促進腫瘤免疫逃逸[19]。Li等[20]研究表明，乳腺癌組織中腫瘤源性CCL22和TGF-β1的相互作用可誘導Treg積聚，并參與Treg的組織浸潤及趨化；Treg可能主要通過腫瘤微環境中細胞因子的表達和受體與細胞因子的相互作用間接影響腫瘤細胞，進而影響乳腺癌的進展。研究結果表明，與單藥組相比，紫杉醇與他莫昔芬聯合用藥下調了免疫調節因子IL-10、TGF-β1和CCL22的分泌。這提示紫杉醇與他莫昔芬聯合用藥可逆轉MCF-7細胞引起的免疫抑制作用，增強機體抗腫瘤殺傷效果。該結論已得到Kassa等[21]的研究結果支持，他們證明紫杉醇通過下調TGF-β1的分泌發揮免疫佐劑作用。

綜上所述，紫杉醇聯合他莫昔芬可能通過下調免疫調節因子IL-10、TGF-β1和趨化因子CCL22的表達發揮協同抗腫瘤作用。