皮下免疫錨定蛋白Z抵抗小鼠肺炎鏈球菌感染的作用研究

劉德軍，楚亞菲，李慧，趙靜

(河南省人民醫院 檢驗科，鄭州 450003)

肺炎鏈球菌是一種普遍存在的傳人病原體，肺炎鏈球菌性肺炎在世界范圍內具有較高的發病率和死亡率。同時，它被認為是社區獲得性肺炎和細菌性腦膜炎的最常見病因，也是中耳炎、鼻竇炎和支氣管炎的主要原因[1]。據估計，全世界每年有近100萬兒童死于肺炎鏈球菌感染。在疫苗使用率較高的國家， 肺炎球菌結合疫苗(pneumococcal conjugate vaccine， PCV)使覆蓋地區的肺炎鏈球菌血清型相關侵襲性肺炎球菌病的發病急劇減少，并在接種肺炎鏈球菌疫苗的個體中誘導了顯著的群體保護[2]。然而，疫苗誘導的肺炎鏈球菌免疫壓力和自然遺傳轉化導致了全球范圍內的血清型替換現象，致使由目前使用的肺炎鏈球菌疫苗不覆蓋血清型引起的侵襲性肺炎鏈球菌病患者數迅速增加[3]。

用保守的肺炎鏈球菌表面蛋白代替多糖作為疫苗是一種很有前途的方法[4]。許多保守的肺炎鏈球菌表面蛋白在臨床前和臨床試驗中都被研究過，比如肺炎鏈球菌膽堿結合蛋白A、基因編輯去除毒性的肺炎溶菌素、化學方法去除毒性的肺炎鏈球菌溶血素，以及肺炎鏈球菌組氨酸三聯體D和E，它們均是近年來的研究熱點，并被納入多組分蛋白疫苗制劑[5]。為了進一步推進肺炎鏈球菌蛋白疫苗的迭代和臨床效果改善，篩選出更多的疫苗候選蛋白是必要的。

錨定蛋白Z(midcell anchored protein Z， MapZ)是肺炎鏈球菌二分裂時的細胞赤道面分子信標。肺炎鏈球菌分裂時，MapZ在細胞赤道處形成環狀結構，并隨著細胞拉長而分開，形成分裂位點的永久信標[6]。二分裂是細菌最常見的分裂方式，演變過程中細菌進化出不同的機制以篩選分裂位點。MapZ和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶STK組成的系統是肺炎鏈球菌細胞分裂位點選擇和形態發生的關鍵靶點[7-8]。在肺炎鏈球菌中，Z環在分裂位點的定位是通過雙位膜蛋白MapZ和Ftsz間的直接相互作用介導的。它不僅可以標記Ftsz的分裂位點和位置，還可以控制Z環閉合。MapZ的缺失會導致肺炎鏈球菌的二分裂障礙，影響細菌增殖[9]。同時，之前的研究表明，這種調節機制在許多種類細菌中普遍存在，且肺炎鏈球菌中的MapZ具有較高的保守性[10]。鑒于MapZ在肺炎鏈球菌分裂增殖中的關鍵作用以及其較高的保守性，其具備成為肺炎鏈球菌候選蛋白疫苗的潛質。因此，研究將驗證皮下免疫MapZ對感染肺炎鏈球菌小鼠的保護作用，以篩選出更有效的肺炎鏈球菌候選蛋白疫苗。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌株 肺炎鏈球菌標準菌株D39(NCTC 7466，血清型2型)，購自歐洲標準菌庫中心；肺炎鏈球菌標準菌株TIGR4(血清型4型)，購自美國菌種保藏中心；肺炎鏈球菌CMCC31436(血清型3型)、CMCC31207(血清型6B型)、CMCC31614(血清型14型)及CMCC31693(血清型19F型)，購自中國藥品生物制品檢定所醫學菌種保藏中心。非小細胞肺癌細胞株A549、大腸埃希菌BL21(DE3)、DH5α和pET-28a(+)載體由科室實驗室保存。

1.1.2 實驗動物 6～8周齡健康雌性C57BL/6小鼠，體質量(18±2) g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。小鼠飼養于SPF級動物房，共33只。所有動物實驗按照鄭州大學實驗動物中心的要求規范操作。

1.1.3 實驗試劑 PrimeSTAR HS高保真DNA聚合酶、dNTPs、5×上樣緩沖液(含Mg2+)、DL2000 DNA marker、限制性核酸內切酶NcoⅠ、SalⅠ、DNA小量純化試劑盒，購自TaKaRa公司；質粒小量抽提試劑盒，購自Omega Bio-Tek股份有限公司；T4 DNA連接酶、鋁佐劑，購自Thermo Fisher Scientific公司；LPS去除試劑盒，購自南京金斯瑞生物科技有限公司；SDS-PAGE 試劑盒，購自上海碧云天生物技術有限公司；Ni-NTA親和層析預裝柱，購自GE公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 MapZ的表達純化與LPS清除 提取肺炎鏈球菌標準菌株D39基因組DNA；以此為模板采用正、反向引物(5′-CCCATATGAGTAAAAAAA-3′和5′-GCGTCGACGTAGTCCAAG-3′)進行MapZ片段PCR擴增。重組質粒pET-28a(+)-MapZ的構建及后續重組蛋白MapZ的表達和純化參考文獻[10]。使用LPS去除試劑盒清除蛋白溶液中LPS。紫外分光光度法測定純化蛋白的濃度后將樣本置于-80 ℃條件下50%甘油中保存。

1.2.2 MapZ重組蛋白抗血清的制備 免疫前于小鼠尾靜脈取血，分離血清作為陰性對照，于-20 ℃保存。每只小鼠經皮下注射抗原(50 μg目的蛋白和50 μL 鋁佐劑)，每隔14 d加強免疫1次，共免疫3次。末次免疫后7 d抽取小鼠心腔血，分離抗血清，于-20 ℃保存備用。

1.2.3 Western blotting分析MapZ在肺炎鏈球菌不同血清型中的同源性 肺炎鏈球菌標準菌株D39(2型)、CMCC31436(3型)、TIGR4(4型)、CMCC31207(6B型)、CMCC31614(14型)及CMCC31693 (19F型)全菌裂解物的制備方法參考文獻[11]。全菌裂解物經SDS-PAGE分離后轉膜。5% BSA封閉膜載體1 h后，以MapZ特異性抗血清為一抗(1∶2 000)，羊抗鼠IgG-HRP為二抗(1∶5 000)，4 ℃過夜孵育；洗膜后用ECL免疫印跡檢測系統檢測免疫復合物的沉積情況。待顯色后通過Image Lab軟件攝片并保存，分析MapZ在肺炎鏈球菌不同血清型中的同源性，即MapZ是否在多種血清型肺炎鏈球菌中均表達。

1.2.4 ELISA檢測MapZ抗血清和不同血清型肺炎鏈球菌表面原位MapZ的結合力 將肺炎鏈球菌標準菌株D39(2型)、CMCC31436(3型)、TIGR4(4型)、CMCC31207(6B型)、CMCC31614(14型)及CMCC31693(19F型)共6種不同血清型分別接種于30 mL C+Y培養液中，于37 ℃、5% CO2條件下培養，至細菌處于對數生長期[D(600 nm)=0.5]時收集細菌。用無菌抗原包被液將不同血清型肺炎鏈球菌(1×106CFU/孔)包被于96孔板。以目的蛋白特異性抗血清為一抗(1∶1 000)，從第1至11孔按梯度稀釋，第12孔作為空白對照；以羊抗鼠IgG-HRP為二抗(1∶5 000)，4 ℃過夜孵育，顯色后于酶標儀讀取光密度[D(540 nm)]值。根據ELISA抗體檢測的標準，梯度稀釋后對應空白孔2.1倍的抗體濃度即為抗體滴度。具體步驟參考文獻[11]。

1.2.5 調理吞噬實驗 自小鼠體內分離原代腹膜巨噬細胞，使用標準程序計數細胞；以DMEM重懸，均勻鋪于24孔板(5×105個/孔)，并于37 ℃、5% CO2條件下培養6 h。熒光染色實驗和菌載量實驗具體步驟參考文獻[11]。調理吞噬實驗中使用的肺炎鏈球菌血清型為肺炎鏈球菌標準菌株D39(2型)。

1.2.6 抗黏附實驗 具體步驟：(1)黏附實驗菌載量的測定。于含10%熱滅活FCS的DMEM中培養A549細胞，使用標準程序計數細胞并以2×105個/孔均勻鋪于24孔板。用MapZ抗血清或正常血清處理肺炎鏈球菌(2×107CFU/孔)，于37 ℃作用30 min。將該懸浮液加入A549細胞培養孔，于37 ℃、5% CO2條件下孵育1 h。經1 mL ddH2O裂解后，接種A549細胞于血瓊脂平板。(2)黏附實驗熒光染色步驟。按上述條件培養A549細胞，使用標準程序計數細胞并以2×105個/孔均勻鋪于24孔板。用MapZ抗血清或正常血清處理FITC標記的肺炎鏈球菌標準菌株D39(2型)(2×107CFU/孔)，于37 ℃作用30 min。將該懸浮液加入A549細胞培養孔，于37 ℃、5% CO2條件下孵育1 h。去除上清液，4%多聚甲醛固定細胞5～10 min，PBS漂洗3次；DAPI染核5～10 min，PBS漂洗3次，封片；于熒光顯微鏡下觀察樣本激發的熒光。

1.2.7 目的蛋白皮下注射免疫C57BL/6小鼠 將C57BL/6小鼠隨機均分為PBS組、MapZ組和MapZ+鋁佐劑組各11只，總共33只。每次分別皮下免疫PBS 100 μL/只、僅MapZ蛋白5.5 μg/只以及MapZ與鋁佐劑的混合物(體積比1∶1，MapZ蛋白5.5 μg/只， 鋁佐劑0.5 mg/只)。每隔2周免疫1次，共免疫3次。

1.2.8 MapZ對小鼠肺炎鏈球菌致死性肺炎模型的保護效果評估 小鼠肺炎鏈球菌致死性肺炎模型的建立： 將肺炎鏈球菌標準菌株D39(2型)接種于血平板，過夜培養，無菌PBS調整其密度至1×108CFU/20 μL；模型的建立及接種劑量的選擇參照文獻[11]；末次免疫2周后使用10%戊巴比妥麻醉小鼠，經鼻滴注菌液30 μL/只，觀察記錄實驗小鼠生存情況21 d。

1.3 統計學處理數據統計分析和作圖采用GraphPad Prism 5軟件。多組數據比較先使用方差分析，再使用Dunnett法進行兩兩比較。對于MapZ抗血清與各肺炎鏈球菌血清型的結合能力(結合滴度轉化為對數)，該數據是“配對的”，來自同一實驗鼠的抗原接種前后，使用配對樣本t檢驗分析。對于生存率，繪制Kaplan-Meier曲線并進行對數秩檢驗以評估顯著性。檢驗水準(α)為0.05。

2 結果

2.1 MapZ的表達純化及分析重組質粒pET-28a(+)-MapZ經PCR 鑒定可呈現特異性條帶，而pET-28a(+)空白質粒無特異性條帶顯示(圖1A)，且重組質粒雙向測序結果與基因庫中編碼肺炎鏈球菌MapZ的序列一致。原核表達MapZ重組蛋白，Ni柱純化并用LPS去除試劑盒清除LPS(LPS<0.1 EU/μg)。10% SDS-PAGE分析所得蛋白，G-250染色后于相對分子質量51 500處見目的條帶(圖1B)，相對分子質量與MapZ相符，純度達95%以上，滿足后續實驗使用要求。

皮下免疫小鼠后，獲得MapZ抗血清，ELISA分析MapZ抗血清和肺炎鏈球菌不同血清型的結合能力。實驗中選用的肺炎鏈球菌血清型包括：肺炎鏈球菌標準菌株D39(2型)、CMCC31436(3型)、TIGR4(4型)、CMCC31207(6B型)、CMCC31614(14型)及CMCC31693(19F型)，均為臨床常見的肺炎鏈球菌感染血清型。結果顯示，MapZ抗血清能夠和多個血清型結合，且相較于正常血清，MapZ抗血清與肺炎鏈球菌的結合能力更強(均P<0.05，圖1C)。為進一步檢測MapZ抗血清的特異性，經Western blotting分析，MapZ抗血清能特異性識別不同血清型肺炎鏈球菌表面MapZ蛋白，且條帶明顯(圖1D)。

2.2 MapZ抗血清對肺炎鏈球菌的調理吞噬作用為進一步評價MapZ抗血清的功能，研究在細胞模型中進行抗體介導的調理吞噬實驗，通過計數100個巨噬細胞計算FITC+巨噬細胞百分比(圖2A)。經統計發現，相較于正常血清組，MapZ抗血清組參與肺炎鏈球菌吞噬的巨噬細胞數顯著增多(P<0.01，圖2B)。與上述結果一致，細菌鋪板計數結果顯示，MapZ抗血清能夠顯著增強巨噬細胞對肺炎鏈球菌的吞噬能力(P<0.01，圖2C)。以上結果表明，MapZ抗血清可顯著增強巨噬細胞對肺炎鏈球菌的吞噬能力。

2.3 MapZ抗血清對肺炎鏈球菌的黏附作用為進一步評價MapZ抗血清的功能，研究在細胞模型中進行抗體介導的抗黏附實驗(圖3A)。通過計算黏附指數，研究發現，相較于正常血清組，MapZ抗血清能夠顯著減少肺炎鏈球菌對A549的黏附(P<0.01，圖3B)。與上述結果一致，細菌鋪板計數示MapZ抗血清組A549細胞表面黏附的細菌數顯著減少(P<0.05，P<0.01，圖3C)。以上結果表明，MapZ抗血清能顯著抑制肺炎鏈球菌對A549的黏附。

2.4 免疫MapZ對肺炎鏈球菌致死性肺炎模型保護效果的評估末次免疫2周后，用肺炎鏈球菌標準菌株D39(2型)鼻腔攻毒各組小鼠，連續監測21 d小鼠的生存情況。結果顯示，MapZ +鋁佐劑免疫組小鼠的半數生存時間顯著長于MapZ單獨免疫組以及PBS對照組(P<0.05，P<0.01，圖4)。

注：A.MapZ重組表達質粒的PCR鑒定，M為DL2000 DNA marker，1為pET-28a(+)-MapZ，2為pET-28a(+)空白質粒；B. 原核表達MapZ的SDS-PAGE分析，M為DL2000 DNA marker，1為MapZ蛋白；C.MapZ抗血清和不同血清型肺炎鏈球菌表面原位MapZ的結合能力；D.Western blotting分析MapZ蛋白結合抗血清的特異性。與正常血清組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖1 MapZ的表達純化及分析

注：A.MapZ抗血清介導的調理吞噬實驗熒光圖(×40)；B.FITC+巨噬細胞百分比；C.調理吞噬實驗菌載量。**P<0.01。圖2 MapZ抗血清對肺炎鏈球菌調理吞噬作用的影響

注：*P<0.05， **P<0.01。圖4 MapZ對肺炎鏈球菌致死性肺炎模型保護效果的評估

3 討論

肺炎鏈球菌正常定位于人體鼻咽部，但其有90多種血清型，臨床常見的有30多種，能導致侵襲性感染如肺炎、腦膜炎和敗血癥[12-13]。該研究旨在探究MapZ作為肺炎鏈球菌蛋白疫苗的潛質。

研究制備的是MapZ蛋白全長，而不僅僅是胞外部分。為驗證MapZ在不同血清型中的同源性，選擇了侵襲能力較強的標準菌株 D39 和在中國普遍流行的CMCC31436(3型)、CMCC31207(6B型)、CMCC31614(14型)及CMCC31693(19F型)等臨床分離菌株[14]。Western blotting和ELISA結果顯示，MapZ抗血清能夠特異性識別不同血清型肺炎鏈球菌中MapZ蛋白，并具有較強的結合能力。為進一步驗證抗血清的功能，使用原代小鼠腹腔巨噬細胞建立調理吞噬及抗黏附實驗模型，并用免疫熒光和菌載量2種方法評價MapZ抗血清的調理吞噬能力。結果提示，MapZ抗血清具有調理吞噬作用，能夠促進巨噬細胞對肺炎鏈球菌的吞噬。在抗黏附細胞模型中，MapZ抗血清能夠顯著抑制肺炎鏈球菌與A549細胞的黏附。

鋁佐劑是人體疫苗接種中使用的主要佐劑[15]，因此研究選擇明礬作為佐劑以驗證MapZ皮下免疫小鼠后抗血清對肺炎鏈球菌感染模型的作用。研究發現，肺炎鏈球菌標準菌株D39致死性劑量鼻腔攻毒后，重組蛋白加鋁佐劑可顯著延長實驗小鼠存活時間。

該研究對MapZ進行了多方面的評估，驗證了其在不同血清型肺炎鏈球菌中的同源性。同時，MapZ抗血清具有調理吞噬作用和抗肺炎鏈球菌黏附能力。MapZ和鋁佐劑能夠有效提高肺炎鏈球菌鼻腔致死性攻毒后小鼠模型的生存率，這充分證明了MapZ是一種具有潛力的肺炎鏈球菌候選蛋白疫苗。