體外應用HDAC抑制劑TSA誘導骨髓細胞分化為MDSC的實驗研究

趙曙光，高偉年，于丁，陳子英

(河北醫科大學第二醫院 心外科，石家莊 050000)

髓源性抑制細胞(myeloid-derived suppressor cell, MDSC； CD11b+Gr-1+Ly6C+F4/80intCD115+)是不完全分化的未成熟骨髓(bone marrow，BM)細胞和骨髓祖細胞(myeloid progenitor cell，MPC)的罕見異質群體[1]。它們在炎癥環境下可從MPC擴增而來[2]，具有抑制T細胞增殖的能力[3]。許多因素可調控MDSC分化，諸因素導致的髓系祖細胞(common myeloid progenitor cell，CMPC) 發育分化異常會生成MDSC[4]。目前文獻可考的誘導MDSC生成的方案多基于GM-CSF、G-CSF、IL-1β、IL-6、LPS等因子的不同組合，IL-6等炎性因子發揮了重要作用[5]。體外研究發現，直接抑制T細胞組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)從而增加組蛋白H3賴氨酸乙酰化，可上調轉錄因子Foxp3轉錄，使T細胞產生免疫抑制活性[6]，因此，HDAC是重要的細胞表觀遺傳輔助調節因子，并經典地調節基因表達。已經證明，單獨應用HDAC抑制劑可抑制DC分化[7-8]并降低這些抗原提呈細胞的刺激能力[9]，減少這些細胞的MHC基因產物、共刺激分子和促炎細胞因子的表達[10]。鑒于HDAC抑制劑具有調控細胞轉錄因子及炎性基因表達的能力，本研究假設廣譜HDAC抑制劑曲古抑菌素A(trichostatin A，TSA)能夠阻止未成熟BM細胞分化為成熟BM細胞，同時應用大劑量GM-CSF使造血細胞向髓樣偏移[11]，從而進一步體外收獲BM細胞來源的MDSC。雖然MDSC是腫瘤生長的“幫兇”[12]，但鑒于其具有抑制移植物抗宿主病(graft versus-host disease，GVHD)和介導實驗性移植耐受的能力[13]，已成為繼Treg后又一個被公認的抑制移植排斥的細胞治療劑[14]。本研究將進一步考察體外獲取的MDSC對異基因效應T細胞的抑制效應。

1 材料與方法

1.1 材料8～12周齡的無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級C57BL/6 及BALB/c雄性小鼠，體質量18～22 g，由北京維通利華實驗動物公司提供，飼養于河北醫科大學動物中心層流房，動物飼料及輔料經60Co輻射處理，飲用水為潔凈級。重組小鼠GM-CSF(recombinant mouse GM-CSF，rmGM-CSF)、抗CD11b-FITC、抗Gr-1-別藻藍蛋白(allophycocyanin，APC)及同型對照抗體購自BD公司，TSA購自Sigma公司，小鼠Treg分選試劑盒、雞尾酒抗體-FITC、抗CD25-藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)、MS及LS分選柱、抗熒光磁珠購自Miltenyi Biotec公司，RPMI 1640培養基、FCS、Ficoll購自Gibco公司，小鼠IL-6 ELISA檢測試劑盒購自晶美公司，MTT購自Sigma公司。FACScalibur E2943型FCM購自BD公司，Multiskom MK3型酶標儀購自雷勃公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠BM細胞及脾臟單個核細胞的制備 采用頸部脫臼法處死C57BL/6小鼠，用乙醇浸泡消毒，摘取小鼠股骨及脛骨，用無菌紗布擦刮附著在骨頭上的殘余肌肉，用生理鹽水將骨髓腔中的BM沖洗至40 μm濾網上，研磨后獲得BM細胞懸液，將細胞懸液置培養箱12 h，取懸浮BM細胞以備培養。摘取小鼠脾臟，剪碎后于40 μm濾網上研磨，獲得脾臟單個核細胞懸液。

1.2.2 TSA與rmGM-CSF聯合對BM細胞的體外誘導 應用抗CD11b-FITC、抗Gr-1-APC標記BM細胞，使用FCM檢測抗原表達情況。將BM細胞分為3組，分別采用TSA、rmGM-CSF、TSA+rmGM-CSF培養， 在第2、4和6天向培養物中加入rmGM-CSF(1 000 U / mL)及TSA(1 nmol/L)，第7天收獲細胞并再次用FCM檢測CD11b、Gr-1抗原表達情況。

1.2.3 各組BM細胞培養液中IL-6水平的ELISA檢測 培養BM細胞第7天，將細胞培養液離心并取上清液，設空白孔，依據試劑盒要求依次加入樣品，封板，37 ℃溫育30 min，棄去液體，甩干，加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復5次。每孔加入酶標試劑 50 μL(空白孔除外)，溫育后再次洗滌，每孔先加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，振蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min。每孔加終止液50 μL終止反應。以空白孔調零，依次測量各孔的光密度[D(450 nm)]值。

1.2.4 小鼠Gr-1+MDSC、CD4+CD25-T細胞及CD4+CD25+Treg的磁珠分選 應用雞尾酒抗體-PE 4 ℃避光標記PBMC 10 min(10 μL含107個細胞)，經緩沖液洗滌2次后加入抗PE磁珠，LS柱陰選細胞為CD4+T細胞。將抗CD25-FITC加入CD4+T細胞標記10 min(10 μL含107個細胞)，緩沖液洗滌2次，加入抗FITC磁珠，經MS柱分選獲取CD4+CD25-T細胞和CD4+CD25+T細胞。應用PE-Gr-1mAb標記體外培養后的BM細胞10 min(10 μL含107個細胞)，經緩沖液洗滌2次后加入抗PE磁珠，LS柱陽選細胞為Gr1+細胞。用以上方法分別獲取C57BL/6小鼠Gr-1+MDSC、CD4+CD25+Treg及BALB/c小鼠CD4+CD25-T細胞以備進一步檢測。

1.2.5 混合淋巴細胞培養 用RPMI 1640普通培養液調整各組細胞數為1×106個/mL，分別設定C57BL/6小鼠Gr-1+MDSC、CD4+CD25+Treg為抑制細胞S1和S2，BALB/c小鼠CD4+CD25-T細胞為應答細胞R。設置CD4+CD25-T細胞對照組及S1+R(1∶1)、S2+R(1∶1)混合組。各組均加入經絲裂霉素滅活的C57BL/6小鼠脾細胞(2×105個/mL)。各組混合細胞放置于37 ℃ CO2培養箱中孵育68 h，觀察細胞的增殖能力。離心后置于含MTT溶液(10 μL/孔)的培養液中4 h，加入鹽酸-異丙醇，用酶標儀檢測D(570 nm)值。

2 結果

2.1 各組誘導培養BM細胞分化及MDSC相關抗原的表達天然BM細胞作為MDSC生成的前體細胞群，在缺乏外界細胞因子刺激的情況下，細胞群MDSC相關標志物Gr-1、CD11-b表達較弱。單獨應用TSA對BM細胞進行誘導后發現，TSA并不能促進BM細胞的分裂增殖，且對BM細胞的分化具有抑制作用，而單獨應用rmGM-CSF可誘導BM細胞向單核粒系細胞偏移，且3 d后細胞增殖明顯加快，第5天細胞分化明顯，出現普遍貼壁現象。在TSA聯合應用rmGM-CSF的情況下，BM細胞增殖快于單獨應用TSA。在培養第7天，檢測各組細胞的MDSC相關標志物發現，TSA組出現CD11b+Gr-1+細胞，但細胞分散且收獲數量較少；rmGM-CSF組CD11b+Gr-1+細胞含量低；TSA+rmGM-CSF組可誘導出CD11b+Gr-1+細胞群，雙陽性細胞約占59.7%，因此認為，所收獲的細胞為富含MDSC的細胞群。(圖1、圖2)

注：A.天然BM細胞；B.單獨應用TSA誘導培養BM細胞7 d；C.單獨應用rmGM-CSF誘導培養BM細胞7 d；D.TSA+rmGM-CSF誘導培養BM細胞7 d。圖1 各組BM細胞CD11b、Gr-1的FACS檢測

注：A.天然BM細胞；B.單獨應用TSA誘導培養BM細胞7 d；C.單獨應用rmGM-CSF誘導培養BM細胞7 d；D.TSA+rmGM-CSF誘導培養BM細胞7 d。圖2 各組BM細胞的分化發育(10×40)

2.2 BM細胞培養液IL-6水平的檢測培養BM細胞第7天，將各組細胞培養液離心并取上清液，使用ELISA檢測IL-6水平。結果顯示，單獨應用rmGM-CSF刺激分化的BM細胞IL-6分泌水平較少[(96±8)pg/mL]，應用TSA刺激分化的BM細胞IL-6分泌水平增加[(232±11)pg/mL]，而TSA+rmGM-CSF刺激分化的BM細胞，其培養液中含有較高水平的IL-6[(514±47)pg/mL]，rmGM-CSF組及TSA+rmGM-CSF組培養液中IL-6水平較單獨應用TSA組差異均有統計學意義(均P<0.05)。(圖3)

注：與TSA組比較，*P<0.05。圖3 ELISA檢測各組細胞第7天培養液中IL-6水平

2.3 磁珠分選Gr-1+BM細胞、CD4+CD25-T細胞及CD4+CD25+Treg應用TSA聯合rmGM-CSF培養的天然BM細胞分化為具有Gr-1及CD11b高表達的細胞群體，應用抗Gr-1-FITC標記細胞群，采用磁珠陽選進一步提高MDSC純度，獲得陽性率為93.8%的CD11b+Gr-1+細胞(圖4A)，將該細胞群視為純度較高的MDSC，同樣采用磁珠分選獲取CD4+CD25-T細胞(圖4B)及CD4+CD25+Treg(圖4C)，將以上3組細胞用于混合淋巴細胞培養。

2.4 混合淋巴細胞培養在混合淋巴細胞培養實驗中，對照組CD4+CD25-T細胞在培養68 h后呈現較強的增殖能力，而當MDSC、CD4+CD25+Treg分別與CD4+CD25-T細胞混合培養(S1+R、S2+R)后CD4+CD25-T細胞的增殖能力均被有效抑制。研究證實，經磁珠分選獲得的MDSC具有較強的抑制T細胞增殖的能力，然而該MDSC對異基因效應T細胞的免疫抑制能力弱于Treg。(圖5)

注：與S1+R組比較， *P<0.05。圖5 MTT法檢測各組混合淋巴細胞培養中CD4+CD25-T細胞的增殖情況

3 討論

到目前為止，特異性調控MDSC分化的因素尚未被發現[5]，現有的諸多體外誘導制備方案均為細胞因子及生長因子的組合，誘導分化效率低下，無法滿足細胞治療的應用[15]。本研究采用外源性HDAC抑制劑參與誘導MDSC形成，其高效的細胞誘導及擴增體系的建立將推進MDSC的基礎與應用研究。

本研究從小鼠BM中獲取天然BM細胞，在體外直接采用HDAC抑制劑(TSA)培養BM細胞，以影響CMPC的正常分化發育，同時聯合大劑量的rmGM-CSF誘導BM細胞向髓系細胞偏移，來獲取更多的MDSC。細胞培養結果顯示，BM細胞在rmGM-CSF方案下3～5 d均有明顯增殖，而在TSA組，細胞分化成熟受到抑制，細胞增殖不明顯。在BM細胞培養的第7天，rmGM-CSF組細胞明顯貼壁，而TSA組貼壁不明顯。因此，認為TSA主要抑制了BM細胞的正常分化發育，而rmGM-CSF則促進了BM細胞向單核粒系細胞的分化和增殖，當用TSA+rmGM-CSF刺激培養BM細胞時，最終收獲的應以單核系MDSC為主。

有文獻報道，鼠MDSC共表達CD11b和Gr-1，分別占正常鼠BM細胞和脾細胞群體的20%～30%和2%～4%[16]。本研究發現，小鼠天然BM細胞低表達CD11b和Gr-1，認為小鼠BM在非炎性及非腫瘤環境中不是形成MDSC的“土壤”。在應用TSA及TSA+rmGM-CSF方案誘導BM細胞7 d后發現，培養細胞Gr-1、CD11b表達明顯增強，雖然TSA作用于BM細胞的詳細機制尚未闡明，但可初步推斷組蛋白乙酰化主要發生在H3、H4的N端比較保守的賴氨酸位置上，H3、H4的乙酰化可打開一個開放的染色質結構，增加特定基因的表達[7]，推測HDAC抑制劑作為細胞表觀遺傳輔助調節因子，可能調控了BM細胞與分化相關的轉錄因子的水平，進而影響了相關基因的表達，從而阻斷了BM細胞分化為成熟的BM細胞。本研究也證實，TSA可以誘導BM細胞炎性因子IL-6的分泌。進一步用磁珠分選的Gr-1+細胞純化MDSC，經混合淋巴細胞培養實驗證實，Gr-1+細胞可以有效抑制CD4+CD25-T細胞的活化增殖，應用TSA 聯合rmGM-CSF方案可以誘導BM細胞向MDSC分化。

綜上所述，TSA聯合大劑量rmGM-CSF可以在體外誘導BM細胞高表達Gr-1、CD11b，誘導出的MDSC呈現較強的免疫抑制活性，具有較高的細胞治療應用價值。目前已知，C/EBP、PU.1及STAT家族轉錄因子可以非特異性地調控MDSC生成[17]，HDAC是重要的表觀遺傳輔助調節因子，組蛋白乙酰化提供了精確的調控機制，但只有其中一小部分基因受HDAC調控抑制[18]。胞內組蛋白乙酰化調控如何影響免疫抑制類細胞的分化尚需進一步闡明。