高表達FcεR1α和共表達NPY-EGFP的RBL細胞系構建及生物學功能檢測

黃倫輝，張嘉懿，李柳栩，張蓓，劉運德，李會強

[1.天津醫科大學 醫學檢驗學院，天津 300203；2．中國醫學科學院血液病醫院(中國醫學科學院血液學研究所) 實驗血液學國家重點實驗室， 國家血液系統疾病臨床醫學研究中心， 天津 300020；3.天津市兒童醫院 檢驗科，天津 300074]

特異性IgE(specific IgE, sIgE)抗體在變態反應性疾病中處于核心地位，其生物功能是通過結合四聚體高親和力IgE受體而介導的。目前，sIgE的檢測是含量測定而非功能測定[1]，與臨床癥狀相關性不高，因為sIgE水平僅僅表示IgE結合過敏原的強度，并不能反映結合過敏原引起的致敏細胞脫顆粒效應。

高親和力IgE受體α鏈(high affinity IgE receptor alpha chain，FcεR1α)在RBL細胞上的表達可用于檢測sIgE與過敏原結合所導致的組胺、5-羥色胺等炎性介質的胞吐[2]。目前，RBL報告系統有RS-ATL8和NFAT-DsRed，用于研究純化的花生過敏原誘導脫顆粒的能力或檢測食物過敏原[3-4]。這2種系統可實現高通量測量，后者也可以與過敏原陣列配合使用[5]，但均不能直接反映脫顆粒效應[6]。

Lang等[7]的研究發現，神經肽Y(neuropeptide Y，NPY)與熒光蛋白融合表達可用于標記神經元細胞系PC12中的顆粒。Azouz等[8]的研究證明，NPY-mRFP也可以用來標記非神經元RBL細胞中的顆粒，用于定量細胞胞吐。本研究假設穩定轉染NPY-增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)和FcεR1α的RBL細胞可以用于人類血清中致敏作用的檢測，通過定量熒光釋放率來評估致敏效應。

1 材料與方法

1.2 方法

1.2.1 基因表達載體的構建 通過NCBI網址查詢獲得FcεR1α、NPY-EGFP的基因序列，由義翹神州生物公司合成并構建質粒pLV-Puro-FcεR1α-T2A-NPY-EGFP-TYK2，對其進行測序鑒定后無內毒素大量提取。

1.2.2 脂質體Lipo2000轉染 取5×105個/孔指數增長期RBL-2H3細胞過夜培養，第2天換5%血清培養液。對照質粒和目的質粒各3 μg，分別加入250 μL無血清培養液，取Lipo2000 20 μL加入500 μL無血清培養液，室溫靜置5 min后分別混合。10 min 后逐滴加至細胞，混勻，37 ℃培養6 h，換完全培養液再繼續培養48 h。

1.2.4 FcεR1α亞基蛋白表達水平的檢測 分別收集一孔轉染前和轉染后的RBL-2H3細胞，用SDS裂解液對細胞進行裂解。采用濕轉的方法將等量的蛋白質轉移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜上。在室溫下用5%脫脂奶粉封閉2 h后，于4 ℃過夜孵育鼠抗人FcεR1α抗體(1∶2 000)，然后用0.05% Tween-20 TBST洗膜3次(10 min/次)，繼續室溫孵育二抗羊抗鼠IgE抗體1 h，在1∶5 000的比例下室溫持續孵育1 h。使用ChemiDoc XRS+成像系統檢測信號。

計數轉染前后細胞各1×105個，以300×g離心10 min。用100 μL FACS緩沖液[2 mmol/L EDTA，0.5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)，500 mL PBS] 重懸細胞，加入1 μL PE標記的鼠抗人FcεR1α抗體，混合后避光置于4 ℃冰箱30 min。然后清洗去除未結合的抗體。最后使用BD FACSVerse FCM進行檢測。

1.2.5 β-氨基己糖苷酶介質釋放試驗 用1∶10稀釋血清對轉染后RBL-2H3細胞于37 ℃孵育1 h進行致敏。過夜培養后，用緩沖液A(140 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl、0.6 mmol/L MgCl2、1.0 mmol/L CaCl2、5.5 mmol/L葡萄糖、0.1%BSA和10 mmol/L哌嗪-1， 4-二乙磺酸，pH7.4)沖洗細胞2次。在預熱的緩沖液A中將稀釋的BLG(1 μg/mL)或羊抗人IgE抗體添加到細胞中(50 μL/孔)，37 ℃孵育30 min。然后收集上清液，用0.2% Triton X-100裂解細胞。以4-甲基傘形酰-N-乙酰基-β-D-葡糖胺(溶于100 mmol/L檸檬酸，pH4.5)為底物，在37 ℃孵育30 min后用0.25 mol/L甘氨酸緩沖液終止反應。在Biotek Synergy2上讀取光密度[D(405 nm)]值，計算β-氨基己糖苷酶釋放率。β-氨基己糖苷酶釋放率=(S-B)/(T-B)×100%，其中B、S、T分別代表培養液、細胞上清液培養液和剩余細胞裂解后培養液的D值。

1.2.6 NPY-EGFP釋放試驗 用Tyrode緩沖液洗滌轉染細胞3次。在96孔板，用稀釋血清過夜致敏，用1 μg/mL BLG在37 °C下孵育30 min。將每孔上清液小心地移到新的96孔板，放在冰上，避光。使用熒光板閱讀器在488 nm激發光和520 nm發射光下測量熒光信號值。NPY-EGFP釋放率=(S-B)/(T-B)×100%，其中B、S、T分別代表培養液、細胞上清液培養液和剩余細胞裂解后培養液的熒光信號值。

2 結果

注：CMV，巨細胞病毒(cytomegalovirus)；RRE，Rev反應元件(Rev response element)；cPPT/CTS，中央聚嘌呤序列(central polypurine tract/central)；mPGK，鼠磷酸甘油酸激酶(mouse phosphoglycerate kinase)；Puro，嘌呤霉素(puromycin)；WPRE，土撥鼠肝炎病毒轉錄后調控元件(woodchuck hepatitis post-transcriptional regulatory element)；Amp，氨芐西林(ampicillin)。圖1 表達載體pLV-Puro-FcεR1α-T2A-NPY-EGFP-TYK2結構示意

2.2 轉染細胞中FcεR1αmRNA的表達用實時熒光定量PCR檢測轉染組和空載組FcεR1αmRNA的相對表達水平,用2-ΔΔCq方法分析數據，以轉染空載質粒表達量作為“1”，轉染組FcεR1α的表達量是空載組基因表達量的165.905 2倍(圖2)。這提示目的基因高表達于RBL-2H3細胞上。

圖2 實時熒光定量PCR 檢測FcεR1α基因表達水平

2.3 受體蛋白的表達使用抗人 FcεR1α 特異性單克隆抗體檢測空載組和目的組細胞中 FcεR1α的表達。目的組在相對分子質量為50 000 處檢測到一條明顯的蛋白條帶，而空載組未能檢測到該條帶(圖3)。

注：1為空載組； 2為目的組。圖3 Western blotting 檢測 FcεR1α 的蛋白表達

使用PE標記的抗人FcεR1α特異性單克隆抗體識別空載組和目的組細胞中FcεR1α的表達情況，目的組陽性細胞率達83.2%。這提示絕大多數受體表達在細胞膜上。(圖4)

圖4 FACS檢測FcεR1α的細胞定位

2.4 受體蛋白活性試驗使用24例過敏陽性血清和1例過敏陰性血清進行β-氨基己糖苷酶介質釋放試驗。過敏陽性血清β-氨基己糖苷酶釋放率為20%～60%，過敏陰性血清在10%以下(圖5)。β-氨基己糖苷酶介質釋放試驗證明了人血清sIgE導致了脫顆粒反應，FcεR1α具有結合血清sIgE的能力。

用相同血清樣本，更換新型指標NPY-EGFP檢測釋放率。過敏陽性血清NPY-EGFP釋放率為20%～80%，與過敏陰性血清可明顯區分(圖6)，這為接下來的診斷指標研究奠定了物質基礎。

注：樣本1～24為過敏陽性血清； 樣本25為過敏陰性血清。圖5 轉染后的RBL-2H3細胞β-氨基己糖苷酶介質釋放試驗

注：樣本1～24為過敏陽性血清； 樣本25為過敏陰性血清。圖6 轉染后的RBL-2H3細胞NPY-EGFP釋放試驗

3 討論

檢測血清sIgE的方法由物理化學法向細胞生物學法過渡是歷史性的進步。細胞生物學法檢測sIgE不僅能反映過敏原結合sIgE的能力，而且能同步反映過敏原的致敏情況，可進一步研究機體的過敏體征。RBL-2H3細胞系的發展基于一種FcεR1α的嵌合受體復合物，其中至少需要轉染人源的α鏈，與大鼠肥大細胞內源性α鏈競爭結合大鼠內源性β、γ鏈[10]。經典RBL-2H3細胞系的一個缺點是某些人血清對大鼠細胞具有細胞毒性，需要將血清高度稀釋方可減少此毒性，但這樣做會導致產生不充分的致敏作用，造成假陰性結果。所以，新一代報告細胞系正在利用敏感報告基因(如熒光素酶或熒光蛋白)替代以前的人源化RBL細胞系，這樣即使使用高達1∶100稀釋度的血清，也可以檢測過敏原sIgE。目前，國外使用2種這樣的人源化RBL報告系統，分別是RS-ATL8和NFAT-DsRed。這2種系統可實現高通量測量，后者也可以與過敏原陣列配合使用。RS-ATL8非常敏感，但有2個主要的缺點：首先，其需要熒光素酶底物，常規使用相對昂貴；其次，RS-ATL8并不適合用于評估過敏原陣列上的活化，因為熒光素酶檢測需要裂解細胞，這會使熒光信號與過敏原結合位點的位置出現錯位[4，11]。為了克服這些缺點，一種類似于RS-ATL8的熒光報告系統NFAT-DsRed被開發出來，通過誘導紅色熒光蛋白表達來報告IgE依賴性活化T細胞核因子核易位[5]。不過，這些報告系統均不能直接反映脫顆粒效應。本研究所構建的工具細胞自帶EGFP，省去添加酶底物的繁瑣步驟和額外花費，同時作為預先合成的新型標志物NPY直接反映了過敏反應中的脫顆粒效應，更好地體現了過敏原與高親和受體表面sIgE的結合，有望實現高通量和高靈敏度檢測。

本研究為開發一種穩定高表達FcεR1α和共表達且便宜的新型指標NPY-EGFP的細胞系奠定了堅實的基礎。從基因水平、蛋白水平、膜蛋白表達水平及功能試驗方面證明了該受體表達的可實現性和優越性，以及重要的新型指標NPY-EGFP開發工作的實現。FcεR1α從基因水平檢測，其表達量特別高，蛋白表達量相對高，但NPY-EGFP熒光強弱不一導致檢測的釋放率不均質。事實上，正是由于瞬時表達基因定位的不確定性，才體現出建立穩定表達細胞系的重要性。通過后期篩選細胞有望得到高表達FcεR1α且具有均質熒光的NPY-EGFP的細胞系。

表達NPY-EGFP的人RBL細胞系的新型報告系統可用于分析與食物蛋白質生物學相關的交叉反應性，鑒定過敏原的生物學特性，診斷食物過敏[12]，研究食物蛋白質的致敏潛力，比較食品加工前后的變應原性。在對受試者的過敏癥狀進行診斷時，須使用純化的過敏原或過敏原提取物，而基于RBL細胞的免疫測定可提供關于全食物產品引起過敏反應的能力信息[13]，篩選潛在的抗過敏食品化合物或功能表位，然后用于針對食物過敏的免疫治療。