保健食品中共軛亞油酸的氣相色譜法測定

翁史昱，周靜，麥成華，張申平

上海市質量監督檢驗技術研究院（上海 200233）

共軛亞油酸（CLA）是亞油酸異構體混合物的總稱，其共軛雙鍵以順式或反式結構存在，目前發現的異構體有20種。2009年原衛生部第12號公告批準共軛亞油酸和共軛亞油酸甘油三酯為新資源食品，共軛亞油酸系列產品越來越受到人們的關注，關于其功能特性、應用和分析方法的研究也不斷深入。研究發現CLA是一種無毒、無遺傳突變的可食用性油脂，被譽為“21世紀綠色營養保健品”[1]。其具有抗動脈硬化[2]、減肥降脂[3-4]、抗癌[5]、抗炎[6-7]等生理功能，具有生物活性的異構體主要以9-cis, 11-trans CLA和10-trans, 12-cis CLA的形式存在[8-10]。

共軛亞油酸廣泛分布在許多食品中，天然CLA主要存在于瘤胃動物牛、羊等的乳及肉制品脂肪中。牛奶是最豐富的天然CLA來源，平均每克牛奶的脂肪中CLA含量在2～37 mg之間[11]。針對共軛亞油酸采用的主要分析方法有氣相色譜法[12-17]、高效液相色譜法[18-20]、紫外光譜法[21]和氣質聯用法（GC-MS）[22]等，或者幾種方法一起使用，達到對共軛亞油酸異構體的分離和鑒別目的。氣相色譜（GC）法是傳統分析脂肪酸的方法，具有快速、高效、靈敏的優點，其分析結果準確度較高，穩定性好，國家和國際標準中都有方法規定[23-24]。通過GC分析CLA的研究報道已有不少，涉及牛乳制品[11-12,14]、驢乳[21]、牛羊乳脂[15,25]、牛肉[13]和芝麻[19]等中的含量檢測，然而現階段研究缺乏應用GC-FID法測定保健食品中CLA的研究，并且國標中尚未見保健食品中CLA的檢測標準。試驗針對保健食品中兩種主要異構體9-cis, 11-trans CLA和10-trans,12-cis CLA的分析方法進行研究，建立2種異構體的準確、靈敏的定量分析方法，滿足實際檢測需求，為該領域的研究提供基礎。

圖1 共軛亞油酸化學結構式

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Agilent 7890A氣相色譜質譜儀（配有氫火焰離子化檢測器，美國Agilent公司）；SIGMA 3K30離心機（德國Sigma公司）；渦旋混合器（德國IKA公司）；SK8210LHC超聲儀（上?？茖С晝x器有限公司）；旋轉蒸發儀（德國Heidolph公司）；萬分位分析天平（美國DENVER公司）；Milli-Q超純水器（美國Millipore公司）；DHG-9053A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海一恒科技有限公司）；N-EVAPTM 111型吹氮濃縮儀（美國Organomation公司）。

9-cis, 11-trans CLA甲酯和10-trans, 12-cis CLA甲酯標準品（美國Nu-Chek公司）；十一碳酸甘油三酯（美國Sigma公司）。

甲醇、甲苯（色譜純，Fisher公司）；乙酰氯、無水碳酸鈉（分析純，國藥集團）；實驗室用水為Milli-Q超純水。

1.2 試驗方法

1.2.1 溶液配制

共軛亞油酸甲酯標準儲備液（10 mg/mL）：準確稱取9-cis, 11-trans CLA甲酯和10-trans, 12-cis CLA甲酯標準品各200 mg置于20 mL容量瓶內，用甲苯定容混勻后制成標準儲備液，于-20 ℃保存。

內標（十一碳酸甘油三酯）儲備液（1.0 mg/mL）：準確稱取100 mg十一碳酸甘油三酯置于100 mL容量瓶內，用甲苯混勻定容后，于4 ℃保存。

共軛亞油酸甲酯標準工作溶液：分別準確移取0.10，0.25，0.50，1.00和2.50 mL共軛亞油酸甲酯標準儲備液于15 mL螺口玻璃管中，每個管中加入0.10 mL內標儲備液。分別加入一定量甲苯定容至5.0 mL。得到共軛亞油酸甲酯質量濃度分別為200，500，1 000，2 000和5 000 mg/L的標準工作溶液。

乙酰氯-甲醇溶液（乙酰氯體積分數10%）：量取40 mL甲醇于100 mL干燥的燒杯中，準確吸取5.0 mL乙酰氯逐滴緩慢加入，不斷攪拌，冷卻后轉移并定容至50 mL干燥的容量瓶中。臨用前配制（乙酰氯為刺激性試劑，配制乙酰氯甲醇溶液時應不斷攪拌防止噴濺，注意防護）。

碳酸鈉溶液（6%）：準確稱取6 g 無水碳酸鈉于100 mL燒杯中，加水溶解，轉移并用水定容至100 mL容量瓶中。

1.2.2 樣品前處理

稱取0.5 g樣品（精確至0.1 mg），加入0.1 mL內標液置于15 mL螺口玻璃管中，在玻璃管中加入5 mL甲苯，加入6 mL 10%乙酰氯甲醇溶液，旋緊螺旋蓋，置于80 ℃烘箱中加熱2 h，取出冷卻至室溫。將反應后的樣液轉移至50 mL離心管中，分別用3.0 mL 6%碳酸鈉溶液清洗玻璃管3次，合并碳酸鈉溶液于50 mL離心管中，混勻，以5 000 r/min離心約3 min。取上清液作為試液，氣相色譜儀測定。

1.2.3 儀器條件

氣相色譜儀具有氫火焰離子化檢測器（FID）；色譜柱為Supelco SP-2560（100 m×0.25 mm×0.2 μm）石英毛細管柱；載氣為氮氣，流量1.0 mL/min；進樣方式為分流進樣，分流比30∶1；進樣口溫度220 ℃；進樣量0.2 μL；FID檢測器溫度300 ℃；燃燒室氣體為氫氣（40 mL/min）、空氣（400 mL/min）；程序升溫為100 ℃保持2 min，以5 ℃/min程序升溫至210 ℃，以2 ℃/min升溫至240 ℃，保持6 min，以10 ℃/min升溫至245 ℃，保持9 min。

2 結果與分析

2.1 試驗條件優化

由于CLA不穩定，很易轉變成其他異構體，所以在測定前必須對樣品進行甲酯化處理。食品安全國家標準GB 5009.168《食品中脂肪酸的測定》中涉及不同食品樣品中脂肪酸甲酯化的方法通常有三氟化硼法、三甲基氫氧化硫法、酯交換法和乙酰氯-甲醇甲酯化方法[26]。這4種方法甲酯化效率不一，適用樣品范圍也不同。酸催化甲酯化方法在酯化過程中易產生其他異構體和含甲氧基反應產物，這些產物影響脂肪酸的分析，因此不太適合脂肪酸甲酯的制備；此外，升高溫度及酯化反應時間也影響甲酯化產物。結果表明，相對其他幾種方法，10%乙酰氯-甲醇法對于粉末狀保健食品中的共軛亞油酸具有更好甲酯化效率。

在分析共軛亞油酸時，順，反構型的共軛亞油酸異構體9-cis, 11-trans CLA甲酯和10-trans, 12-cis CLA甲酯在脂肪酸常規分析的Carbowax類型的固定相色譜柱上都可以分開，但其他的脂肪酸（C18∶1N9c和C18∶1N9T）會在60 m色譜柱上與這2個峰相重疊。為了得到更好分離效果，必須使用極性更強、柱長更長的毛細管柱[11]。該方法采用SP-2560這一極性非常強的脂肪酸甲酯測定專用毛細管柱分離、測定共軛亞油酸異構體，在實際粉末狀保健食品測定的研究得到應用，說明所建立的試驗條件準確可靠。

2.2 方法的線性范圍及檢出限

測定5個系列濃度的共軛亞油酸甲酯標準溶液，以內標校正標準曲線法定量測定。以目標化合物峰面積/內標物質峰面積的比值為縱坐標，以標準溶液濃度/內標物質濃度的比值為橫坐標，繪制標準曲線。共軛亞油酸的具體標準曲線方程及相關系數見表1。

從表1看，在相同的檢測條件下，9-cis, 11-trans CLA和10-trans, 12-cis CLA的系列標準質量濃度在200～5 000 mg/L時，線性相關系數r2均為0.999，能滿足檢測要求。

以被測物質的信噪比S/N≥3時的進樣濃度定為檢出限（LOD），S/N≥10時的進樣濃度為定量限（LOQ）。在取樣量0.5 g、定容體積5.0 mL前處理條件下，試驗方法對9-cis, 11-trans CLA甲酯的定性檢出限為0.594 g/100 g；定量檢出限為1.98 g/100 g；對10-trans, 12-cis CLA甲酯的定性檢出限為0.707 g/100 g；定量檢出限為2.36 g/100 g。按照0.952 4的折算系數，折算9-cis, 11-trans CLA和10-trans, 12-cis CLA的定量檢出限，分別為1.89和2.25 g/100 g。

表1 共軛亞油酸甲酯的回歸方程、相關系數、線性范圍和檢出限

2.3 回收率及精密度試驗

以1份保健食品為樣品，在9，18和36 g/100 g 3個水平下進行加標回收試驗。

參照GB/T 27417—2017附錄A～C對于檢測方法確認的技術要求，方法的回收率與精密度滿足檢測的要求。

表2 共軛亞油酸的加標回收率和相對標準偏差（n=6）

2.4 實際樣品測定

圖2 典型陽性樣品的目標物色譜圖

用該方法對2份粉末狀保健食品中9-cis, 11-trans亞油酸和10-trans, 12-cis亞油酸進行檢測，樣品檢出譜圖見圖2。具體檢測結果顯示，2份保健食品中的9-cis, 11-trans亞油酸分別為8.474和8.444 g/100 g；而10-trans, 12-cis亞油酸為8.825和8.804 g/100 g。

3 結論

通過優化衍生溶液體系，粉末狀保健食品基質中2種共軛亞油酸物質的回收率得到有效提高，通過簡化前處理步驟，優化色譜分離程序，建立回收率高、準確性高、穩定性強的保健食品中9-cis, 11-trans亞油酸和10-trans, 12-cis亞油酸的分析方法。該方法經實際樣品檢測證實，具有快速、準確、靈敏的特點，適合日常實驗室批量測定保健食品中的共軛亞油酸。