雙抗體夾心ELISA檢測花生致敏蛋白Ara h 2的方法建立

王耀，劉勝男，邢榮花，張淑霞，王玲玲，郭保寶

1. 河南科技大學食品與生物工程學院（洛陽 471023）；2. 三門峽海關（三門峽 472000）；3. 安陽海關（安陽 455000）；4. 鄭州海關技術中心（鄭州 450002）；5. 三門峽市檢驗檢疫中心（三門峽 472000）

隨著生活水平的不斷提高，消費者對食品安全程度的關注水平也發生了變化，不僅關注食源性致病菌、農獸藥殘留、違法添加等外源性問題，而且關注轉基因、食物過敏等內源性問題。食物過敏是人體暴露于某種食物后反復發生，由特定免疫應答引起的不良反應[1]。致敏物質通常為食物中的蛋白質或糖蛋白[2]。近年來，食物過敏發病率呈現逐年上升趨勢[3]，但由于缺乏有效治療方法，患者只能通過避免食用含致敏物質的食物以防止過敏反應[4]。因此，很多國家通過頒布法規或標準，對食品標簽中標識致敏物質進行強制要求[5]。中國現行食品安全國家標準——GB 7718—2011《預包裝食品標簽通則》中將致敏物質標識作為推薦內容，但在最新的修訂征求意見稿中將致敏物質作為基本標示內容。因此，研究食品中致敏物質的高效快速、靈敏特異檢測方法對于致敏物質標識監管、保障過敏消費者食品安全具有重要意義。

花生是八大主要致敏食物之一[6]，其含有多種致敏蛋白，因此花生及其制品在很多國家和地區的食品標簽要求中被列為需要標識的致敏物質之一。已鑒定出的花生致敏蛋白有13種，其中Ara h 2是主要致敏蛋白之一，能被大多數花生過敏患者的血清識別[7]。Ara h 2占花生蛋白總量的5.9%～9.3%，由于結構中二硫鍵較多使其具有結構穩定、耐酶解的特點[8]。用于花生致敏物質檢測的方法主要包括聚合酶鏈式反應（PCR）、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）和質譜法（MS）等方法[9]，其中PCR和ELISA是食品中致敏成分篩查中最常用的快速定性和定量分析方法[10]。PCR方法基于標志性基因進行檢測，難以準確反映是否含有致敏物質[11]，而ELISA方法可直接針對致敏蛋白進行檢測。試驗基于所制備的Ara h 2兔源多抗和鼠源單抗，通過雙抗體夾心檢測原理，建立花生致敏蛋白Ara h 2的ELISA檢測方法，并對其檢測特性進行鑒定，以期為食品標簽中致敏物質標識的高效監管提供支撐，更好地保障過敏消費者的食品安全。

1 材料與方法

1.1 試劑與溶液

花生致敏蛋白Ara h 1、Ara h 2（美國INDOOR生物技術公司）；大豆球蛋白、卵清蛋白、酪蛋白、牛血清蛋白、3, 3’, 5, 5’-四甲基聯苯胺（美國Sigma-Aldrich試劑公司）；HRP標記的山羊抗兔IgG抗體（索萊寶生物科技公司）；Ara h 2鼠源單抗、Ara h 2兔源多抗及超純水由實驗室制備；其他試劑（均為市售分析級）。

ELISA包被液采用0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液（CBS）；稀釋液采用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）；洗滌液含0.05% tween-20的PBS（PBST）；封閉液含5%脫脂奶的PBST溶液；顯色液采用3, 3’, 5,5’-四甲基聯苯胺（TMB）緩沖液；終止液采用2 mol/L H2SO4溶液。

1.2 儀器與設備

BSA224S型電子天平（德國Sartorius公司）；Multiskan FC型酶標儀（美國Thermo Scientific公司）；Vortex2型振蕩器（艾卡儀器設備有限公司）；SZCL-2型控溫磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責任公司）；HPX-9052MBE型恒溫培養箱（上海博迅實業有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 雙抗體夾心ELISA基本步驟

利用Ara h 2 鼠源單抗（mAb）作為捕獲抗體，用于ELISA酶標板的包被。將mAb用CBS稀釋，加入100 μL/孔酶標板，4 ℃條件下包被過夜；洗板，即用PBST沖洗酶標板4次并拍干（下同），拍干后將封閉液加入200 μL/孔酶標板，37 ℃條件下封閉1 h；洗板并將包被好的酶標板在4 ℃條件下密封保存備用。

進行檢測時，將樣液加入100 μL/孔酶標板，同時設置陰性孔（加入PBS 100 μL），37 ℃條件下孵育1 h后洗板；利用Ara h 2 兔源多抗（pAb）作為檢測抗體，將pAb用封閉液稀釋，加入100 μL/孔酶標板，37 ℃條件下孵育30 min后洗板；將HRP標記的山羊抗兔IgG抗體（GaRIgG-HRP）用封閉液按1∶5 000倍稀釋，加入100 μL/孔酶標板，37 ℃條件下孵育30 min后洗板；將顯色液加入100 μL/孔酶標板，室溫靜置反應10 min；將終止液加入100 μL/孔酶標板終止反應，并用酶標儀讀取各孔OD450nm值。

1.3.2 捕獲抗體和檢測抗體工作濃度的優化

采用棋盤法優化抗體工作濃度[12]。將mAb用CBS稀釋為1∶5 000，1∶10 000，1∶15 000和1∶20 000這4個稀釋度，每個稀釋度100 μL/孔包被酶標板2行（包被程序同上）。將確定濃度的Ara h 2標準溶液加入第1行100 μL/孔，將PBS作為陰性對照加入第2行100 μL/孔，37 ℃條件下孵育1 h后洗板；將pAb用封閉液稀釋為1∶5 000，1∶10 000，1∶15 000和1∶20 000這4個稀釋度，每個稀釋度100 μL/孔加入3列酶標板，37 ℃條件下孵育30 min后洗板；加入GaRIgG-HRP孵育，顯色、終止并讀取OD450nm值。得到各稀釋度下測定Ara h 2標準溶液的OD450nm平均值（P值）和陰性對照的OD450nm平均值（N值），將P/N最大時所對應mAb和pAb的稀釋度分別作為捕獲抗體和檢測抗體的最佳工作濃度。

1.3.3 方法檢測特性鑒定

1.3.3.1 靈敏度鑒定

靈敏度通過方法的檢測限（LOD）確定，檢測限越低，則靈敏度越高。利用優化抗體工作濃度后的雙抗體夾心ELISA對一系列梯度濃度的Ara h 2標準溶液進行檢測。將各標準溶液濃度對數值作為橫坐標，檢測所得OD450nm值作為縱坐標，得到雙抗體夾心ELISA的標準曲線。重復檢測20次空白樣品，根據標準曲線的線性回歸方程計算求得濃度，計算濃度平均值（X）和標準差（δSD），以X+3δSD作為方法的檢測限[13]。

1.3.3.2 準確度鑒定

將5%脫脂奶作為添加基質，向其中加入Ara h 2標準品溶液，配制成不同添加濃度的樣品，利用雙抗體夾心ELISA對每個濃度樣品重復檢測6次，通過計算添加回收試驗的平均回收率及變異系數（CV）以鑒定方法的準確度[14]。

1.3.3.3 特異性鑒定

通過交叉反應試驗鑒定方法的特異性[15]。分別配制高濃度的花生致敏蛋白Ara h 1、大豆球蛋白、卵清蛋白、酪蛋白、牛血清蛋白等其他常見致敏蛋白溶液，利用雙抗體夾心ELISA檢測并設置陰性對照。若其他致敏蛋白的OD450nm值（P值）和陰性對照OD450nm值（N值）的比值P/N小于2.1，則說明與其他致敏蛋白無交叉反應，特異性良好。

1.3.3.4 穩定性鑒定

將已包被mAb的酶標板在4 ℃條件下避光密封保存，分別在保存的0，30，60和90 d時，利用雙抗體夾心ELISA檢測特定濃度的Ara h 2標準溶液并設置陰性對照，計算P/N值，通過對比不同保存時間檢測所得P/N值的差異鑒定方法的穩定性[16]。

2 結果與分析

2.1 捕獲抗體和檢測抗體的工作濃度

利用已包被不同稀釋度mAb的酶標板進行棋盤試驗，通過不同稀釋度的pAb對50 ng/mL的Ara h 2標準溶液及陰性對照進行檢測，根據所得到的不同抗體稀釋度對應的OD450nm值計算P/N值。結果如表1所示，mAb以1∶15 000稀釋包被酶標板，pAb以1∶10 000稀釋進行檢測時，計算所得P/N值最大，因此捕獲抗體mAb和檢測抗體pAb最佳工作濃度分別為1∶15 000稀釋和1∶10 000稀釋。

表1 捕獲抗體和檢測抗體工作濃度的優化

2.2 靈敏度

配制1，2，4，8，16，32，64，128和256 ng/mL的Ara h 2標準溶液用于建立方法標準曲線。以各標準溶液濃度的對數值為橫坐標，以檢測所得OD450nm值為縱坐標，得到如圖1所示的標準曲線，其線性范圍為2～128 ng/mL，回歸方程為y=1.348 6x-0.368 6（R2=0.986 7）。通過重復檢測空白樣品，計算檢測結果平均值（X）和標準差（δSD），方法檢測限X+3δSD為2.32ng/mL，說明雙抗體夾心ELISA的靈敏度較高。

2.3 準確度

分別配制10，50和100 ng/mL 3個Ara h 2添加濃度5%脫脂奶溶液樣品，利用雙抗體夾心ELISA對每個添加濃度的樣品進行6次重復檢測。各添加濃度溶液樣品的平均回收率及CV結果如表2所示。回收率處于87.6%～93.3%，CV處于7.3%～10.7%，表明方法準確度較高。

圖1 雙抗體夾心ELISA標準曲線

表2 雙抗體夾心ELISA準確度鑒定結果

2.4 特異性

分別配制質量濃度為200 ng/mL花生致敏蛋白Ara h 1、大豆球蛋白、卵清蛋白、酪蛋白和牛血清蛋白溶液。利用雙抗體夾心ELISA檢測所得OD450nm值（P值）和陰性對照OD450nm值（N值）結果如表3所示。各致敏蛋白的P/N值均小于2.1，說明方法與其他常見致敏蛋白無交叉反應，具有較強的特異性。

表3 雙抗體夾心ELISA特異性鑒定結果

2.5 穩定性

利用雙抗體夾心ELISA分別在已包被mAb酶標板保存的0，30，60和90 d檢測50 ng/mL的Ara h 2標準溶液，P值和N值結果如表4所示，在不同保存時間，P/N值均無較大變化，表明在4 ℃避光密封保存條件下，酶標板可穩定保存至少90 d，說明方法具有良好穩定性。

表4 雙抗體夾心ELISA檢測方法穩定性鑒定結果

3 結論

依據雙抗體夾心ELISA原理，利用Ara h 2鼠源mAb作為捕獲抗體，提高對于單一致敏蛋白的高親和力特異性捕獲能力，以Ara h 2兔源pAb作為夾心檢測抗體，增強對致敏蛋白的高效識別，建立可靈敏準確、特異穩定的檢測花生致敏蛋白Ara h 2的雙抗體夾心ELISA方法。通過對檢測特性進行鑒定，方法檢測限為2.32 ng/mL，添加回收試驗回收率為87.6%～93.3%，方法與其他致敏蛋白無交叉反應，且可在4 ℃避光密封條件下保持90 d內檢測結果穩定。試驗方法與已有的基于多抗研制的商品化ELISA試劑盒相比[17]，在靈敏度和特異性上表現出一定優勢，可用于食品標簽中花生致敏物質標識信息的快速篩查，為食品安全監管提供高效的監測手段和技術支撐。