固定化乳酸菌發酵桑葚飲料工藝

杜延兵 ，慕鴻雁，何忠寶 ，張自立

1. 山東商務職業學院（煙臺 264670）；2. 山東省糧油食品工程技術研發中心（煙臺 264670）；3. 青島農業大學食品科學與工程學院（青島 266109）

桑葚是多年生桑科桑樹的成熟果實，又名桑果、桑棗、桑實、葚子、烏葚等，可直接食用[1]。桑葚極具營養價值，現代研究證實，成熟的桑葚果實中含有豐富的活性蛋白、維生素、氨基酸、胡蘿卜素、礦物質等成分[2]，營養價值是蘋果的5～6倍，是葡萄的4倍，具有調節免疫、抗氧化[3]、降糖、降血脂[4]、抗癌、抗突變、抗衰老[5]、抗疲勞[6]等作用。

桑葚牛奶復合飲料既有牛奶的香氣，又有桑葚所特有的清香，口感風味獨特[7]，營養保健價值更高[8]。雖然有利用固定化乳酸菌發酵果蔬汁飲料的研究報道[9-14]，但桑葚牛奶復合飲料的開發研究幾乎沒有，故試驗以桑葚汁和牛奶為主要原料，采用海藻酸鈉作為包埋劑，對固定化乳酸菌發酵生產桑葚牛奶復合飲料的工藝進行研究，為實際生產應用提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

新鮮成熟桑葚、新鮮牛奶、精制白砂糖；乳酸菌混合菌粉（含保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌，比例1∶1，實驗室保藏）；氯化鈣、氫氧化鈉、海藻酸鈉、抗壞血酸、CMC-Na（均為分析純）。

MRS液體培養基：蛋白胨10.00 g，牛肉膏10.00 g，酵母浸粉5.00 g，葡萄糖20.00 g，吐溫80 1.00 mL，磷酸氫二鉀2.00 g，乙酸鈉5.00 g，檸檬酸氫二胺2.00 g，硫酸鎂0.50 g，硫酸錳0.25 g，加蒸餾水至1 000 mL，調酸度至pH 6.2～6.4，高壓滅菌（0.1 MPa，121℃）15 min備用。

1.2 試驗設備

YXQ-SG46-280S高壓滅菌鍋（上海博訊實業有限公司）；SPX-250B恒溫恒濕培養箱（常州市華普達教學儀器有限公司）；TGL-16C高速臺式冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠）；754型紫外-可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司）；101A-1型電熱恒溫水浴鍋（龍口市先科儀器公司）；HR-1843榨汁機（飛利浦（中國）電子公司）；WLS-201型精密溫度計（青島隆盛希望電子有限公司）；FA2004電子天平（奧豪斯國際貿易有限公司）；PHS-25型pH計（上海天達儀器有限公司）。

1.3 工藝流程

桑葚→預處理→榨汁→過濾→調pH→滅菌→加入滅菌牛奶→接種→發酵→過濾→發酵液→調配→二次殺菌→成品 ↑ ↑ ↑菌種→活化→固定化 固定化膠珠 白砂糖、穩定劑

1.4 操作要點

1.4.1 桑葚汁制備

將挑選出的合格桑葚放入3～4倍的無菌水中清洗，重復3次，置于通風處瀝干，用榨汁機進行榨汁，同時添加60 mg/L的SO2進行護色[15]，用孔徑0.150 mm的過濾網進行過濾，收集的濾液即為桑葚汁。

1.4.2 調pH

用飽和碳酸鈉溶液調節桑葚汁的pH至中性[13,15]。

1.4.3 殺菌

在75 ℃殺菌15～20 min。

1.4.4 活化

將乳酸菌混合菌粉接種于MRS液體培養基內，在37 ℃恒溫培養至對數期[13,16]，取適量菌液，加入等體積的0.9%氯化鈉溶液制成菌懸液。

1.4.5 固定化

取10 mL菌懸液，加入到一定濃度的海藻酸鈉溶液中混和均勻，用無菌注射器吸取混合液緩緩滴入2%氯化鈣溶液中造粒，固定化1.5～2 h過濾得直徑2.5～3.0mm膠珠，用無菌水洗滌3次，備用[17]。

1.4.6 接種、發酵

以一定接種量接入固定化膠珠，恒溫發酵36 h[14]。

1.4.7 調配

發酵液中加入6 g白砂糖和0.2 g CMC-Na[18]，以改善產品的感官品質。

1.5 指標測定

1.5.1 pH的測定

采用PHS-25型pH計測定pH。

1.5.2 乳酸含量的測定

采用酸堿中和滴定法[19]測定乳酸含量。

1.5.3 還原糖含量的測定

采用3, 5-二硝基水楊酸（DNS）比色法[20]測定還原糖含量。

2 結果與分析

2.1 桑葚汁與新鮮牛奶體積比對發酵的影響

分別以桑葚汁與新鮮牛奶體積比2∶1，4∶1，6∶1，8∶1和10∶1比例配成發酵原液100 mL，按照1.3和1.4操作，取樣測乳酸含量。試驗條件：海藻酸鈉溶液質量分數2.0%、接種量8%、發酵溫度36 ℃。影響見表1所示。

表1 發酵原液配比對發酵的影響

乳酸含量隨著發酵原液中桑葚汁所占比例增大而降低，若發酵原液中桑葚汁所占比例過大，則乳酸菌生長受其營養物質所限，發酵效果較差，酸味小甚至無酸味；若桑葚汁所占比例過小，會導致桑葚的特有風味被牛奶覆蓋，并且產酸量增加使牛奶變性凝結，不利于發酵的正常進行。結合感官評定結果，確定最佳桑葚汁與新鮮牛奶體積比為6∶1。

2.2 海藻酸鈉溶液濃度對發酵的影響

分別以質量分數1.0%，1.5%，2.0%，2.5%和3.0%的海藻酸鈉溶液對乳酸菌進行固定化，按照1.3和1.4操作，取樣測乳酸含量。試驗條件：桑葚汁與新鮮牛奶體積比6∶1，接種量8%，發酵溫度36 ℃。影響見表2所示。

表2 海藻酸鈉溶液濃度對發酵的影響

隨著海藻酸鈉溶液質量分數增加，乳酸含量逐漸降低，膠珠強度不斷升高。在質量分數分別為1.5%，2.0%和2.5%時，乳酸含量的差別并不明顯，結合感官評定結果，確定海藻酸鈉溶液質量分數為2.0%。

2.3 接種量對發酵的影響

分別以接種量4%，6%，8%，10%和12%進行接種，按照1.3和1.4操作，取樣測乳酸含量。試驗條件：桑葚汁與新鮮牛奶體積比6∶1，海藻酸鈉溶液質量分數2.0%，發酵溫度36 ℃。影響見圖1所示。

圖1 接種量對乳酸含量的影響

隨著接種量增加，乳酸含量呈先上升后下降趨勢。接種量8%時，乳酸含量達到最高，這是因為接種量過高會對乳酸菌的生長產生抑制作用。由此可見，最適接種量為8%。

2.4 發酵溫度對發酵的影響

分別在30，32，34，36和38 ℃溫度下按照1.3和1.4操作，取樣測乳酸含量。試驗條件：桑葚汁與新鮮牛奶體積比6∶1，海藻酸鈉溶液質量分數2.0%，接種量8%。影響見圖2所示。

隨著發酵溫度升高，乳酸含量呈先上升后下降趨勢，發酵溫度36 ℃時，乳酸含量最高。這是因為溫度低于36 ℃時，乳酸菌生長總量較小，隨著溫度升高，乳酸菌生長逐漸變得旺盛，溫度升至36 ℃時，菌體最多、活力最大；溫度高于36 ℃時，隨著溫度的升高，乳酸菌菌體逐漸老化，活力降低，不利于產酸。因此，最適發酵溫度為36 ℃。

圖2 發酵溫度對乳酸含量的影響

2.5 正交試驗

為全面考察各因素對發酵的影響，在單因素試驗的基礎上選擇桑葚汁與新鮮牛奶體積比、海藻酸鈉溶液質量分數、接種量、發酵溫度進行L9(34)正交試驗，因素水平表見表3，正交試驗結果見表4。

由表4可知，影響發酵效果的各因素主次關系為A＞C＞D＞B，最佳發酵工藝條件組合為A1B2C2D1，即桑葚汁與新鮮牛奶體積比5∶1、海藻酸鈉溶液質量分數2.0%、接種量8%、發酵溫度35 ℃。此組合不在試驗設計中，因此需要做驗證試驗，按照最佳條件A1B2C2D1，平行試驗3次，得平均乳酸含量為0.606%，平均還原糖含量為6.112 g/100 mL。

表3 因素水平表

表4 正交試驗結果

2.6 產品品質指標

2.6.1 感官指標

色澤均勻一致呈淡紫色；組織均勻穩定無分層，無沉淀；酸甜可口，既有奶香味又有桑葚特有的香氣。

2.6.2 理化指標

乳酸0.606%，還原糖6.112 g/100 mL，pH 4.5。

3 結論

利用固定化乳酸菌發酵生產桑葚牛奶復合飲料的最佳工藝條件為：桑葚汁與新鮮牛奶體積比5∶1，海藻酸鈉溶液質量分數2.0%，接種量8%，發酵溫度35 ℃。在此條件下，生產的桑葚牛奶復合飲料口感純正、風味獨特且營養豐富，是一種新型營養產品，試驗結果為桑葚相關產品的開發及綜合利用提供理論依據。