BALF 熒光定量PCR 與血清ELISA 檢測兒童大葉性肺炎合并肺炎支原體感染的效果比較

李 萍，楊豐梅，劉 慧，宮春飛

支原體肺炎（mycoplasma pneumonia，MP）約占所有兒童肺炎的20%～30%。大葉性肺炎又稱為肺炎球菌肺炎，即肺炎雙球菌等細菌感染所致的呈大葉性分布的急性肺部炎癥。近年來諸多調查報道，大葉性肺炎合并支原體感染（mycoplasma infection）在兒童中的發病率呈攀升趨勢。現階段，血清學方法是診斷大葉性肺炎合并支原體感染的主要方法，但其檢測結果往往受抗體時相等多因素影響，致使診斷效果差強人意。支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）是下呼吸道病原感染檢測的可靠標本，為了進一步完善大葉性肺炎并MP感染患兒的診療效果，筆者回顧性分析2017 年1月—2019 年12 月筆者醫院80例患兒的臨床資料，對其BALF 熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測肺炎支原體DNA 的結果與血清酶聯免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測MP 特異性IgM 抗體（mycoplasma pneumonia mmunoglobulinM，MP-IgM） 的結果進行對比，以期完善大葉性肺炎合并MP 患兒的診療方案，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料回顧性分析2017 年1 月—2019 年12 月于筆者醫院進行支氣管肺泡灌洗的80例大葉肺炎合并MP 感染患兒的臨床資料。納入標準：符合《諸福棠實用兒科學》（第9 版）中的診斷標準；所有患兒家屬均對研究內容知情同意。排除標準：急慢性感染；其他肺部疾病；血液系統與免疫系統疾病患者。80例患兒中男42例，女38例；年齡1～14 歲，平均（8.5±3.0）歲；其中≤8 歲37例，＞8 歲43例；病程≤7 d 者51例，＞7 d 者29例；肺部右肺上葉20例，右肺中、下葉病變34例，左肺下葉6例，左肺上葉20例。

1.2 方法入組患兒在入院后1～6 d 通過ELISA法實施MP-IgM 檢測，并行纖維支氣管鏡檢查，以BALF 熒光定量PCR 檢測MP-DNA。

1.2.1 ELISA 法檢測MP-IgM 采集患兒的靜脈血，通過ELISA 法（試劑盒購自北京海瑞祥生物科技有限公司）實施MP-IgM 檢測，具體操作嚴格按照說明書執行。同時，根據試劑說明書中的標準，判斷入組患兒MP-IgM 陽性情況，其中抗體水平950 kU/L 以上為陽性，770～950kU/L為弱陽性，770kU/L以下為陰性。

1.2.2 BALF 熒光定量PCR 檢測MP-DNA 纖維支氣管鏡檢查前禁食水6 h，術中實施靜脈與局部麻醉方法，以2%利多卡因局麻咽喉，纖維支氣管鏡經咽喉、鼻、聲門進入氣道，評估支氣管形態，將37 ℃左右的生理鹽水灌洗到嚴重受累的肺段、肺舌葉或肺中葉，1 ml/kg，至少3 次。采用負壓吸引，留取BALF，將纖維支氣管鏡緩慢拔出。操作期間給予吸氧，常規檢測患兒的血壓、心率、血氧飽和度等指標，并密切觀察口唇、呼吸、面色等體征。回收的BALF 在30 min 內進行細菌培養與MP-DNA 檢測。檢測方法：BALF 放置在離心管內，以12000 r/min的速度離心5 min，半徑為3.5 cm，管底沉淀提取DNA 標本，具體操作嚴格按照說明書執行。同時，根據試劑說明書中的標準，判斷本組MP-DNA 陽性情況，即1×103copy/ml 為陽性。

1.3 觀察指標（1） 觀察并對比入組患兒血清ELISA 與BALF 熒光定量PCR 檢測的陽性率。（2）觀察并對比不同病程患兒血清ELISA 與BALF 熒光定量PCR 檢測的陽性率。（3）觀察并對比不同年齡患兒血清ELISA 與BALF 熒光定量PCR 檢測的陽性率。

1.4 統計學方法采用SPSS 20.0 統計學軟件進行數據分析，計數資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 患兒血清ELISA 與BALF 熒光定量PCR 檢測的陽性率比較入組患兒經BALF 熒光定量PCR檢測的陽性率91.25%（73/80），高于血清ELISA檢測的48.75%（39/80），差異具有統計學意義（χ2=34.405，P=0.000）。見表1。

表1 患兒血清ELISA 與BALF熒光定量PCR 檢測的陽性率比較（例）

2.2 不同病程患兒MP 的檢測結果對比血清ELISA 檢測病程≤7 d 者的陽性率低于＞7 d 者的陽性率（P＜0.01），而BALF 熒光定量PCR 檢測病程≤7 d 者與＞7 d 者的陽性率對比差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 不同病程患兒MP 的檢測結果比較［例（%）］

2.3 不同年齡患兒MP 的檢測結果對比血清ELISA 檢測年齡≤8 歲者的陽性率低于＞8 歲者的陽性率 （P＜0.01），而BALF 熒光定量PCR 檢測年齡≤8 歲者與＞8 歲者的陽性率對比，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 不同年齡患兒MP 的檢測結果比較［例（%）］

3 討論

兒童大葉性肺炎是由肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌等感染所引起的肺部急性炎癥性病變，通常累及肺葉的大部分或全部，臨床表現為高熱、咳嗽、寒戰、胸痛、咳鐵銹色痰等癥狀，可伴有呼吸窘迫、呼吸困難與發紺，具有起病急、進展快、療程長、恢復慢等特點，給兒童的健康帶來了嚴重的影響。近年來，隨著人們生活方式與生存環境的變化，大葉性肺炎合并支原體感染也呈攀升趨勢，二者合并后使治療更為棘手，而明確病原是診治的關鍵。目前，大葉性肺炎主要采用影像學與實驗室方法檢測，一旦合并MP 則使檢測更為繁雜，其中MP 分離培養與鑒別對其具有顯著的鑒別診斷效果。然而，MP 分離培養與鑒別耗時較長，通常為2～3 周，加之要求高、敏感性差，所以在臨床應用中受到了一定的限制。此外，雖然MP 感染可以通過雙份血清MP 抗體滴度升高4 倍及以上進行確診，但抗體出現在2～4周，加之受患兒免疫、年齡、病程等因素的影響，所以漏診率較高，容易延誤患兒的治療時機。因此，探尋一種快速且高效的方法及時明確兒童大葉性肺炎合并支原體感染十分必要。

熒光定量PCR 是一種新型的基因檢測技術，其通過檢測患兒肺炎支原體核酸水平明確疾病類型。部分研究認為，相較于傳統PCR 技術，熒光定量PCR 具有高特異性、高敏感性、無交叉反應等優勢，有效避免了假陽性對檢測結果的干擾。同時，熒光定量PCR 所檢測的BALF 標本直接取自支氣管肺泡，所以準確性更高。該文研究結果顯示，該組患兒經BALF 熒光定量PCR 檢測的陽性率91.25%高于血清ELISA 檢測的48.75%（P＜0.01）。雖然血液標本更易獲得，但檢測效果卻不夠理想；大葉性肺炎合并MP 患兒往往因肺不張需要行BALF，十分利于獲到取BALF 標本，且檢測效果更為直接與準確。同時，血清ELISA 檢測病程≤7 d、年齡≤8 歲的陽性率低于＞7 d、＞8 歲的陽性率（P＜0.01），而BALF 熒光定量PCR 檢測病程（≤7 d 與＞7 d）、年齡（≤8 歲與＞8 歲） 的陽性率對比差異無統計學意義 （P＞0.05）。可見，與血清ELISA 檢測相比，BALF 熒光定量PCR 所檢測到的陽性結果不受病程與年齡的影響。需要注意的是，一旦大葉性肺炎合并MP 患兒確診后，應及時采取合理的抗生素治療，當單純大環內酯類抗生素效果不佳時，應積極探尋病因，以及混合感染的病原體，之后通過聯合、合理、對癥的頭孢菌素與青霉素類等抗生素，確保患兒的整體治療效果。

總之，相較于血清ELISA，BALF 熒光定量PCR檢測兒童大葉性肺炎合并MP 的效果更為理想，適于臨床推廣。