致血液感染的活潑瘤胃球菌的分離與鑒定*

周曉君，軒斷斷，張冠男，牛莉娜，蘇嶼，譚奇燕，鄧垂文，王旭明

(1.海南醫學院病原生物學教研室海南醫學院—香港大學熱帶傳染病聯合實驗室，海口571199；2.海南省人民醫院 海南醫學院附屬海南醫院檢驗科，海口 570311；3.中國醫學科學院 北京協和醫院風濕免疫科 國家皮膚與免疫疾病臨床醫學研究中心，北京100730)

活潑瘤胃球菌(Ruminococcusgnavus)為專性厭氧、無孢子、無動力或有動力、革蘭陽性球菌，屬于人類、牛、綿羊和山羊等腸道正常菌群。革蘭陽性厭氧球菌(gram-positive anaerobic cocci, GPAC)約占臨床厭氧致病菌的25%～30%[1]。國外有關活潑瘤胃球菌感染的報道偶見[2]，但國內相關報道罕見。本研究對1例結腸息肉摘除后患者血培養中分離的活潑瘤胃球菌進行多種方法的鑒定，以輔助臨床診斷治療。

1 材料與方法

1.1臨床資料 患者女，55歲，1個月前于外院行結腸鏡檢查，提示“升結腸可見一大小約2.5 cm×2.0 cm隆起突變，中央凹陷”，因“大便性狀改變半年，發現結腸息肉1個月”于2020年8月3日入院就診。入院檢查：體溫36.5 ℃，清蛋白38.3 g/L，C反應蛋白、腎功能相關生化指標正常，血常規正常。行結腸息肉摘除術后第6天，患者發熱，寒顫，體溫39.2 ℃，清蛋白37.3 g/L，C反應蛋白29.22 mg/L，降鈣素原0.275 ng/mL，血液檢查：白細胞14.97×109/L，中性粒細胞比例90.4%，不排除感染。留2套血培養檢查。血培養第3天2瓶厭氧血培養瓶報告陽性，涂片可見革蘭陽性球菌，呈單個或鏈狀排列。需氧瓶未見報告陽性警告，結合患者癥狀，考慮血源性感染。根據《國家抗微生物治療指南》和β-內酰胺類抗生素/β-內酰胺酶抑制劑復方制劑臨床應用專家共識(2020年版)[3]，給予頭孢哌酮鈉/他唑巴坦抗感染治療，每次2 g，每天2次，靜脈滴注。血培養第4天報告：血培養有厭氧菌活潑瘤胃球菌生長。繼續抗感染7 d，患者無寒顫發熱，白細胞正常，C反應蛋白正常，術后恢復順利，給予出院。

1.2主要試劑與儀器 哥倫比亞血瓊脂平板、不加抗生素巧克力平板、厭氧培養基(鄭州安圖生物公司)，質控菌株大腸埃希菌 ATCC 8739(法國生物梅里埃公司)，DNA提取試劑盒Wizard Genomic DNA Purification Kit(美國Promega公司)，PCR擴增引物由廣州天一輝遠公司合成；Vitek 2 Compat全自動生化鑒定系統及配套厭氧菌及棒狀桿菌鑒定卡(ANC)、Vitek MS微生物MALDI-TOF MS鑒定儀及靶板、基質液和甲酸(法國生物梅里埃公司)，PCR儀(美國Eppendorf公司)，DYY-6G型電泳儀(北京六一儀器廠)，ABI 3730XL自動測序儀(美國Applied Biosystem公司)。

1.3細菌培養 抽取血培養陽性肉湯，直接涂片革蘭染色鏡檢，同時接種于哥倫比亞血平板，巧克力平板(不加抗菌藥物)和厭氧血平板，5% CO2培養箱37 ℃溫育24 h，哥倫比亞血平板、巧克力平板(不加抗菌藥物)均無細菌生長，厭氧血平板可見灰白色半透明菌落。將初代厭氧血平板菌落進行耐氧試驗，獲得專性厭氧菌并進行革蘭染色鏡檢，觸酶試驗觀察生化反應特性。用Vitek 2 Compact全自動生化鑒定系統及ANC卡進行生化鑒定試驗。

1.4基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)鑒定 用無菌接種環取菌并均勻涂于靶板，加入1 μL α-氰基-4-羥基肉桂酸+乙腈(CHCA)基質液，待完全干燥后，使用MALDI-TOF MS鑒定，將所得質譜圖與MALDI-TOF MS RUO數據庫中的質譜圖進行匹配。

1.516S rRNA基因檢測 取厭氧哥倫比亞血平板上的菌落按Wizard Genomic DNA Purification kit說明書提取基因組DNA。PCR擴增基因組DNA 16S rRNA基因，按試劑盒說明書操作，正向引物：5′-AG

TTTGATCMTGGCTCAG-3′，反向引物：5′-GGTTACC

TTGTTACGACTT-3′。反應體系: DNA提取物1 μL,10 μmol/L上、下游引物各1 μL,2×PCR Mix 10 μL，ddH2O補足至20 μL。反應條件:94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30個循環；72 ℃ 7 min。PCR產物經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，使用自動凝膠成像系統分析。將瓊脂糖凝膠分離的目的條帶，用PG溶膠液溶膠，磁珠純化吸附DNA，酒精去雜質，最后洗脫液(水)溶出DNA，得到純化好的目的基因。由廣州天一輝遠公司在ABI 3730XL自動測序儀上進行雙脫氧鏈終止法(Sanger法)測序，結果用GenBank數據庫進行比對。用MEGA5軟件構建分離菌的系統進化樹。

2 結果

2.1細菌培養 專性厭氧血平板培養24 h后可見直徑約1 mm的圓形、灰白色、半透明、濕潤、邊緣光滑的菌落，無溶血環(圖1)。細菌革蘭染色陽性，著色弱，球形或類球形，單個、成對或鏈狀排列(圖2)，觸酶試驗陰性，H2S試驗陽性,分解葡萄糖，ANC卡生化試驗:α-阿拉伯糖苷酶、d-2脫氧核糖、蔗糖、D-木糖、D-葡萄糖、D-麥芽糖、七葉苷水解試驗為陽性，ID信息置信水平結果顯示：不能鑒定的細菌。

圖1 厭氧平板培養24 h的菌落形態

圖2 菌落涂片革蘭染色

2.2細菌鑒定 分離菌株的MALDI-TOF MS質譜圖與RUO數據庫中已有的活潑瘤胃球菌質譜圖比較，吻合度最高，鑒定為活潑瘤胃球菌，置信度為83.7%，見圖3。菌落基因組16S rRNA PCR產物為1 446 bp,測序結果與已知活潑瘤胃球菌 ATCC 29149T序列號(NR 036800.1)16S rRNA基因同源性為99%，系統進化樹分析顯示分離菌與活潑瘤胃球菌ATCC 29149T位于同一分支(圖4)，鑒定為活潑瘤胃球菌，登錄號為MT998949.1。

圖3 分離菌株的MALDI-TOF MS鑒定結果

圖4 分離菌的系統進化樹分析

3 討論

活潑瘤胃球菌屬于胃瘤菌屬，可以引起過敏、狼瘡性腎炎、脊椎關節炎和炎癥性腸病，其與克羅恩病發生最為密切[4]。其致病機制不明，可能與人體B細胞反應相關[5]，也可能通過2,7-唾液酸酐產生并代謝N-乙酰神經氨酸，清除黏蛋白中的唾液酸獲得營養優勢[6]有關。

本分離菌株經耐氧試驗證實該菌只在厭氧條件下生長，初步判斷為厭氧菌。細菌生化等手工鑒定方法操作繁瑣，鑒定時間長而且也只能鑒定出有限菌株。Vitek 2 Compat全自動生化鑒定結果顯示為不能鑒定的細菌，可能原因有：該菌為專性厭氧菌，生化反應不活潑；菌株生化譜不典型；不符合Vitek 2數據庫中的菌株分類群。近年來，隨著MALDI-TOF MS在臨床廣泛應用，越來越多的疑難菌種被鑒定。本研究使用MALDI-TOF MS檢測分離株，得到的質譜圖與RUO數據庫中已有的活潑瘤胃球菌質譜圖比較，置信度為83.7%，與前研究一致。Fontanals等[7]發現血培養陽性標本經過處理，可以直接通過MALDI-TOF MS鑒定菌株。Fernández-Caso等[8]利用MALDI-TOF MS能夠較好地鑒定出活潑瘤胃球菌。隨著基因組學的興起，分子生物學檢測方法倍受關注，雖然16S rRNA檢測價格昂貴，但是準確度高。本研究通過分離菌株16S rRNA測序，結果與GenBank數據庫中Blast比對，顯示該菌與活潑瘤胃球菌ATCC 29149T(序列號NR036800.1)的同源性為99%，由分離株的系統進化樹可知，該分離菌與標準菌株活潑瘤胃球菌ATCC 29149T位于同一分支，鑒定為活潑瘤胃球菌，登錄號為MT998949.1。

綜上，本文患者分離菌株經MALDI-TOF MS與16S rRNA基因檢測，鑒定為Ruminococcusgnavus。MALDI-TOF MS和16S rRNA是當前Ruminococcusgnavus臨床菌株有效的鑒定方法，2種方法具有較好的應用前景。菌種快速鑒定不但可以對致病性病原菌進行快速診斷，輔助臨床診斷治療，為臨床用藥提供依據；又可以監測致病菌菌種分布情況。此外，菌種快速準確鑒定為早期預防公共衛生突發性病原傳染性疾病提供了科學根據，同時為鑒別診斷提供了篩查手段。