糞便性狀及分析前標本處理方式對鈣衛蛋白檢測結果影響探討

曾俊祥，高莉梅，余悠悠，潘秀軍

(上海交通大學醫學院附屬新華醫院檢驗科，上海 200092)

糞便鈣衛蛋白(fecal calprotectin, FC)是一項較為理想的評估腸道黏膜炎癥的非侵襲性標志物，目前被廣泛用于炎癥性腸病患者的鑒別診斷、病情評估及療效監測等方面，從某種角度而言，FC的結果是臨床治療決策的重要條件，FC結果的誤差往往會延誤炎癥性腸病患者尤其是患兒的治療[1]。但由于糞便成分復雜，FC在檢測過程中有較多影響實驗結果的因素，特別是分析前階段[2]，被認為是分析誤差的主要來源，但國內對此認識極少。因此，本研究試分析萃取方式、離心條件對不同性狀糞便的FC測定結果的影響，以期進一步優化檢測流程，為規范糞便FC檢測實驗操作提供依據。

1 材料和方法

1.1標本來源 收取2020年4月至2020年6月期間在上海交通大學醫學院附屬新華醫院進行糞便FC項目檢測后的剩余標本370例，排除由于量過少不適合進行多次提取的標本后，最后得到357例，置于-20 ℃凍存。

1.2試劑與儀器 糞便鈣衛蛋白檢測試劑盒及配套采樣管(ELISA法，瑞士BüHLMANN公司)、糞便標本采樣保存管(廈門為正生物公司)；Multiskan Ascent酶聯儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)，VORTEX旋渦混合儀(江蘇康健醫療用品公司)，Multiskan Ascent 酶聯儀(美國 Thermo Fisher Scientific 公司) 。

1.3樣本處理

1.3.1樣本性狀評估 按照布里斯托大便分類量表(Bristol stool scale，BSS)，將標本性狀分為水樣(BSS=7)、膠凍(BSS=5、6)、軟糊(BSS=3、4)、堅硬(BSS=1、2)。

1.3.2樣本采樣 采樣前，所有標本在室溫下保存4 h復溫。選取4類不同性狀的大便標本各3例，分別進行稱量法和采樣器采樣法采樣。(1)稱量法采樣：由于堅硬便標本難以均質化，在標本不同位置采用多點采樣法，而其他性狀標本使用一次性攪拌棒進行徹底勻漿，采樣后置于清潔試管中，應用Metler AG-160分析天平稱量每支試管采樣前后的重量，依次標號并記錄。(2)采樣管采樣：分別用檢測試劑盒配套采樣管(采樣管A)、糞便標本采樣保存管(采樣管B)采樣。

1.3.3抽提及萃取 (1)稱量法萃取：按照檢測試劑說明書，以每毫克標本加入50 mL萃取液的比例，根據各標本質量，依次加入對應體積萃取液進行萃取。(2)采樣管法萃取：嚴格按照萃取管操作說明書進行。

1.3.4混勻與溶解 所有樣本在加入萃取液后，在VORTEX旋渦混合儀上渦旋震蕩15 min，使其充分溶解混勻后備用。

1.4FC檢測 按照試劑盒說明書進行操作，采用ELISA法進行FC檢測。

1.5研究方法

1.5.1采樣方式對糞便FC檢測結果影響 隨機選取4類不同性狀的糞便標本各10例，同時用稱量法和采樣器采樣法分別進行采樣、萃取，混勻溶解完畢后同時采用ELISA法進行檢測。以稱量法結果作為標準，分別計算采樣管A、B的結果偏移度，公式：平均偏移度=(采樣管A/B結果-稱量法結果)/稱量法結果×100%。

1.5.2離心條件對糞便FC檢測結果影響 所有樣本進行性狀評估后，隨機抽取10例標本(每種形狀樣本至少1例)，每例平均分為4份，采用稱重法進行采樣、萃取，在檢測前分別以2 000 r/min離心5 min、3 000 r/min離心5 min、4 000 r/min離心5 min、3 000 r/min離心10 min這4種條件進行離心，檢測離心前、后結果。

1.5.3離心對不同性狀糞便FC檢測結果的影響 每種性狀的標本隨機選取各10例，按照上一步離心條件結果進行離心操作，計算不同性狀標本離心后結果偏移度，公式：(離心后結果-離心前結果)/離心前結果×100%。

1.5.4離心對高、中、低值區間糞便FC檢測結果的影響 標本分別按照不離心和離心進行操作，檢測FC結果。對結果進行回顧性分析，按照離心前(不離心)結果分為高值區段(>800 μg/g)、中值區段(200～800 μg/g)、低值區段(<200 μg/g)，計算不同值區間段標本離心后結果偏移度，公式：(離心后結果-離心前結果)/離心前結果×100%。

2 結果

2.1采樣方式對糞便FC檢測結果影響 隨機選取4類不同性狀的大便標本共12例，同時使用2種商用化采樣器及人工稱重法采樣，并將按2種采樣方式后檢測的FC結果進行了比較。裝置A所得結果較稱量法所得結果平均偏移度為27.2%，裝置B達到57.5%。采樣裝置對于水樣便和堅硬便的提取效果較稱重法結果差距較大。見圖1。

2.2離心條件對糞便FC檢測結果影響 抽取10例標本，每例平均分為4份，以不同離心條件進行離心，各離心條件下離心后FC結果、未離心結果比較差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。而離心的轉速(2 000 r/minvs. 3 000 r/minvs. 4 000 r/min)之間、離心時間(3 000 r/min 5 minvs. 3 000 r/min 10 min)之間結果差異無統計學意義(P>0.05)，故選擇2 000 r/min離心5 min作為最終離心條件。

表1 離心條件對鈣衛蛋白檢測結果的影響

2.3離心對不同性狀糞便FC檢測結果的影響 隨機選取每種性狀標本各10例，離心前后FC濃度的結果及人工稱重法提取的結果見表2。水樣、糊狀、膠凍、堅硬4種不同性狀糞便離心后FC結果平均偏移度為-0.6%、-24.1%、-30.3%、-37%。離心前、后水樣便FC結果差異無統計學意義(P>0.05)，而其他性狀的糞便結果差異有統計學意義(P<0.05)。除水樣便，其他3種性狀標本采樣管法采集時離心前的結果與稱量法結果差異有統計學意義(P<0.05)，離心后的結果與稱重法結果差異無統計學意義(P>0.05)，表明離心后的結果更加接近稱重法的結果。

表2 不同性狀糞便鈣衛蛋白離心前后檢測結果影響

2.4離心對高、中、低值區間糞便FC檢測結果的影響 對常規檢測結果回顧性分析，按照結果分為3個區間段，各區段離心前、后結果見表3。離心后中值和高值區段較離心前FC結果出現下降，而低值區段結果差異無統計學意義(P<0.05)。

表3 離心前后對低、中、高值區段糞便鈣衛蛋白檢測結果影響

3 討論

稱重法采樣是FC檢測標準的采樣方法，但該操作步驟復雜，費時費力，目前大多采用商品化采樣管對糞便進行萃取，但采樣管本身沒有標準，因此廠家根據實際情況各自設計或交付代工廠生產，各類采樣管的內部構造、精密度不盡一致[3-4]。FC的檢測方法最早是R?seth等[5]報道的，2000年在此基礎上T?n等[6]進行了方法改進，后續不斷改良。現今較為認可的檢測流程為樣本勻漿、稱量法采樣、等比萃取、離心、樣本孵育、樣本測定。而商品化試劑盒最大的不同主要在于簡化分析前操作流程，除了替換掉稱量法，還省去離心步驟，盡管此舉便于臨床推廣，但如此也會帶來分析誤差。

采樣管基本原理是使用固定的容積，以等同于固定的糞便重量。這是基于所有糞便具有同樣的密度，而不同性狀的糞便顯然密度不一，使用均一的采樣管，勢必無法確保采樣的準確性。本研究比較了不同采樣管采樣的FC結果，發現2種采樣管與稱量法結果均存在一定偏移。值得注意的是，采樣裝置對于水樣便和堅硬便的提取效果較稱重法結果差距較大，考慮的原因主要是萃取裝置的采樣棒對稀便黏附性差，因此采樣量不足；而堅硬便的密度過大，同時采樣棒容易黏附多余的糞便進入萃取體系，導致采樣量偏多。

本研究發現離心后較離心前的FC結果有所降低，分析其原因可能是糞便中某些有形成分如膽原等造成非特異性吸附，影響檢測結果，離心后取上清液可減少這類殘留物，同時我們的結果提示離心后FC結果與稱量法更為接近，進一步佐證并強調離心這個步驟的重要性。但改變離心條件前后FC結果差異并無統計學意義，因此，建議糞便在用采樣裝置采樣后均應進行離心操作。

本研究為橫斷面研究，無法前瞻性地按照標準入組病例，而實際上患者的年齡、飲食、服藥情況等諸多因素均會影響實驗檢測結果，我們在之前也有過相關報道[7-8]，后續我們會繼續關注檢測結果的解讀及分析后研究。

本研究結果表明，按照現有商品化采樣管的方法，對硬度較大及液態的糞便采樣具有較大誤差。對此我們建議，對于液態稀便不宜使用采樣管，而應使用定量移液管，堅硬糞便應先用銼刀進行樣本均質操作后再進行采樣操作。盡管國外Roche?、Immunodiagnostik AG?等采樣裝置宣稱更精準穩定，但迫于成本等因素制約，在國內常規應用難度極大。因此，我們呼吁有必要對國內商品化采樣裝置的制作工藝、樣本性狀針對性等細節方面進行進一步改良。同時，對于采樣好的標本，均應進行離心操作以降低非特異性反應導致的結果偏差。應做好分析前處理，以確保FC結果的可靠性，讓其更具有臨床參考價值。