1例復(fù)合雜合突變所致的凝血因子Ⅻ缺乏癥家系分析*

鄒安慶，王明山，金艷慧，夏虹，劉斯奇，陳怡

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院a.醫(yī)學(xué)檢驗中心，b.血液科，浙江溫州325000)

凝血因子Ⅻ(coagulation factor Ⅻ，F(xiàn)Ⅻ)是一種單鏈糖蛋白，由肝細(xì)胞產(chǎn)生，呈現(xiàn)為一種非活性絲氨酸蛋白酶前體分泌到血漿，相對分子質(zhì)量(Mr)為80 000，由596個氨基酸殘基組成[1]。FⅫ可激活內(nèi)源凝血途徑，并參與纖溶途徑的激活。先天性FⅫ缺乏癥是一種常染色體隱性遺傳病，其病因常為位于染色體5q33-qter上的FⅫ基因突變[2]。其可分為3類：交叉反應(yīng)物質(zhì)陰性(CRM-)型(FⅫ:Ag不能被檢測)、陽性(CRM+)型(FⅫ:Ag正常)和降低(CRMred)型(FⅫ:Ag降低)。然而，有些FⅫ缺乏癥患者出血表現(xiàn)輕微，有些患者可發(fā)生靜、動脈血栓[3-5]。FⅫ基因的46T/T型在肺血栓患者中比例更高，而凝血因子Ⅻ活性更低[6]。本研究報告1例FⅫ缺乏癥患者，分析先證者與其家系的表型與基因型，同時利用生物信息學(xué)軟件分析突變的可能危害，初步探討其分子發(fā)病機(jī)制。

1 對象和方法

1.1對象 先證者，男性，54歲，溫州人，吸煙35年，2020年3月26日因“胸悶咳嗽1月余”到溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院就診，擬“肺占位損傷”收治入院。入院后完善相關(guān)檢查，CT示“右肺中央型肺癌伴中下葉阻塞性不張”，氣管鏡檢查見右總支氣管、氣管下端新生物，病理提示鱗癌及鱗狀上皮重度不典型增生伴癌變。常規(guī)凝血功能檢查發(fā)現(xiàn)活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time，APTT)179.2 s，查凝血因子發(fā)現(xiàn)FⅫ活性(coagulant factor Ⅻ activity，F(xiàn)Ⅻ:C)為1%，F(xiàn)Ⅻ抗原(coagulant factor Ⅻ antigen，F(xiàn)Ⅻ:Ag)含量為1%。先證者肝腎功能檢查結(jié)果正常，平時無明顯自發(fā)出血或血栓形成癥狀，診斷為FⅫ缺乏癥。先證者及其家系(共3代6人)參與本研究，包括先證者及其父親、妻子、長子、女兒和次子。家系成員均無自發(fā)出血傾向，也無血栓形成史，否認(rèn)近親婚配。家系遺傳圖譜見圖1。

圖1 遺傳性FⅫ缺乏癥家系圖

100名體檢健康者作為正常對照，男53名、女47名，平均年齡32歲(年齡范圍16～60歲)，均無肝腎疾病，無血栓或出血史。

所有研究對象均簽署知情同意書。本研究得到溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號：2012-17)。

1.2標(biāo)本采集與處理 采集先證者及家系成員外周靜脈血2.7 mL于含0.109 mol/L枸櫞酸鈉的真空采血管中，3 000 r/min離心10 min，上層血漿用于凝血指標(biāo)檢測，下層血細(xì)胞用于提取基因組DNA和PCR擴(kuò)增。

1.3主要儀器與試劑 STA-Max全自動血凝儀(法國Stago公司)，ABI 2720 PCR擴(kuò)增儀(美國Applied Biosystems公司)，ABI PRISM 3700測序儀(美國Applied Biosystems公司)；PT、APTT和FⅫ:C等凝血試劑(法國Stago公司)；FⅫ:Ag檢測試劑盒(上海西唐生物科技公司)；DNA提取試劑盒(北京天根生化科技公司)。

1.4方法

1.4.1血凝功能檢測 凝血功能試驗，包括APTT、PT和FⅫ:C，均采用一期凝固法測定。采用ELISA法測定FⅫ:Ag。

1.4.2DNA抽提和PCR擴(kuò)增 按試劑說明書抽提先證者及家系成員外周血基因組DNA。根據(jù)NCBI中的FⅫ基因序列(GenBank登錄號：AF538691)，應(yīng)用Primer 5軟件共設(shè)計7對引物以覆蓋FⅫ基因的14個外顯子區(qū)域及其側(cè)翼序列，引物序列見表1。由上海桑尼生物科技公司合成。

PCR擴(kuò)增：反應(yīng)體積共25 μL，包括Taq PCR Master mix 12.5 μL，ddH2O 7.5 μL，DNA模板3 μL，正向引物1 μL，反向引物1 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，根據(jù)不同引物分別以相應(yīng)退火溫度(54～60 ℃)退火30 s，72 ℃延伸45 s(共35個循環(huán))，72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物采用Goldview標(biāo)記，在15 g/L瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，經(jīng)電泳檢測合格的PCR產(chǎn)物送上海桑尼生物科技公司測序。測序結(jié)果用Chromas軟件與美國NCBI基因庫所公布的FⅫ基因序列(GenBank登錄號:AF538691.1)進(jìn)行比對，尋找基因突變位點，發(fā)現(xiàn)錯義突變位點則通過反向測序予以證實。先擴(kuò)增先證者FⅫ各外顯子及側(cè)翼序列和5′、3′端非翻譯區(qū)，發(fā)現(xiàn)突變位點后再擴(kuò)增其他家系成員相應(yīng)外顯子片段。

表1 FⅫ基因PCR擴(kuò)增引物序列

1.4.3突變位點氨基酸保守性及危害性分析 用ClustalX-2.1-win軟件將突變氨基酸(Cys247和Gly542)與其7種同源物種(小家鼠，褐家鼠，黑猩猩，獼猴，家犬，牛和熱帶爪蟾)的氨基酸序列進(jìn)行比對，分析突變氨基酸的保守性。同源物種氨基酸序列來源：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/homologene。

通過4個在線生物信息學(xué)軟件：PolyPhen-2(http:∥genetics.bwh.harvard.edu.pph2)，PROVEAN(http:∥provean.jcvi.org/seq_submit.php)，SIFT(http:∥sift.jcvi.org)，MutationTaster(http:∥www.mutationtaster.org)(蛋白質(zhì)參考ID：P00748和蛋白質(zhì)參考轉(zhuǎn)錄本ID：ENST0000025 3496)，用評分結(jié)果預(yù)測突變對蛋白質(zhì)功能的影響。

2 結(jié)果

2.1凝血指標(biāo)檢測結(jié)果 家系成員表型檢測顯示先證者父親、長子、女兒和次子的FⅫ:C和FⅫ:Ag減少，F(xiàn)Ⅻ:C分別為43%、45%、53%和51%；FⅫ:Ag分別為48%、43%、54%和57%。APTT、PT和Fib測定結(jié)果顯示，父親、長子和女兒的APTT較對照組延長。其他指標(biāo)未見異常。家系成員的表型和基因型見表2。

2.2FⅫ基因分析結(jié)果 先證者FⅫ基因DNA測序發(fā)現(xiàn)，先證者第1外顯子啟動子區(qū)46C/T位點多態(tài)性為46T/T型、第9外顯子存在c.797G>A雜合錯義突變(導(dǎo)致p.Cys247Tyr)、第14外顯子存在c.1681G>A雜合錯義突變(導(dǎo)致p.Gly542Ser)。先證者父親和長子存在c.797G>A突變雜合子，女兒和次子存在c.1681G>A突變雜合子，妻子為野生型。見表2和圖2。

表2 FⅫ缺乏癥家系表型及基因型檢測結(jié)果

注：A，第1外顯子啟動子區(qū)46T/T型；B，第9外顯子c.797G>A雜合突變型；C，第9外顯子c.797G>A野生型；D，第14外顯子c.1681G>A雜合突變型；E，第14外顯子c.1681G>A野生型。

2.3突變氨基酸保守性及危害性分析結(jié)果 人類FⅫ基因突變位點氨基酸與NCBI數(shù)據(jù)庫提供的其他7個同源性物種基因氨基酸進(jìn)行多重比對，結(jié)果顯示Cys247和Gly542這2個氨基酸在這7個物種間高度保守,見圖3和圖4。

圖3 Cys247保守性分析結(jié)果

圖4 Gly542保守性分析結(jié)果

4個生物信息學(xué)軟件分析結(jié)果表明，c.797G>A錯義突變的預(yù)測結(jié)果為“有害”和“致病性”；c.1681G>A錯義突變的預(yù)測結(jié)果為“可能有害的”、“有害”、“影響蛋白質(zhì)功能”和“致病性”。見表3。

表3 生物信息學(xué)軟件對c.797G>A和c.1681G>A錯義突變的預(yù)測結(jié)果

3 討論

FⅫ由596個氨基酸(AA)組成，可分為數(shù)個結(jié)構(gòu)/功能區(qū)[7]，自氨基末端起分別是Ⅱ型纖維連接蛋白區(qū)(AA1-88)、表皮生長因子區(qū)(AA94-131)、Ⅰ型纖維連接蛋白區(qū)(AA133-173)、表皮生長因子區(qū)(AA174-210)、Kringle區(qū)(AA215-295)、富脯氨酸區(qū)(AA296-349)和催化區(qū)(AA354-596)。其中催化區(qū)是發(fā)揮酶解功能的關(guān)鍵，包含激活區(qū)和絲氨酸蛋白酶區(qū)，活性部分由組氨酸(393)、天冬氨酸(442)和絲氨酸(544)殘基組成。

本家系研究發(fā)現(xiàn)，先證者的FⅫ基因上存在3個遺傳變異，包括第1外顯子46T/T位點多態(tài)性和2個錯義突變(第9外顯子存在c.797G>A雜合錯義突變導(dǎo)致p.Cys247Tyr和第14外顯子存在c.1681G>A雜合錯義突變導(dǎo)致p.Gly542Ser)。查詢相關(guān)文獻(xiàn)，Kanaji等[8]于1998年首次報道了第1外顯子啟動子區(qū)46C/T位點多態(tài)性。c.1681G>A雜合突變也已有報道[9]。而c.797G>A雜合突變?yōu)樯形匆妶蟮肋^的新突變。根據(jù)家系研究結(jié)果，先證者FⅫ:C和FⅫ:Ag顯著減少并接近0，表明突變屬于CRM-型。先證者父親、長子、女兒和次子的突變屬于CRMred型，因為FⅫ:Ag分別下降為48%、43%、54%和57%。

c.797G>A和c.1681G>A這2個突變位點分別位于FⅫ的Kringle區(qū)和催化區(qū)。相關(guān)文獻(xiàn)報道，c.1681G>A(p.Gly542Ser)位點位在活性位點Ser544附近，突變后改變了氨基酸的極性，影響催化位點的細(xì)微空間構(gòu)象并最終影響FⅫ活性。體外瞬時表達(dá)亦顯示c.1681G>A突變導(dǎo)致FⅫ變異蛋白合成減少，并伴有分泌障礙[10-11]。

c.797G>A是一個新發(fā)現(xiàn)的突變，導(dǎo)致p.Cys247Tyr。FⅫ蛋白的Kringle結(jié)構(gòu)域包含215～295個氨基酸殘基，在增強激肽釋放酶裂解敏感性方面起到一定作用[12]。在Kringle結(jié)構(gòu)域中已經(jīng)報道過這幾個突變：p.W222G、p.G240E和p.R248G[12-13]。p.G240E和p.R248G的體外表達(dá)實驗研究表明，這2種突變在高爾基體前室發(fā)生了廣泛的細(xì)胞內(nèi)降解，導(dǎo)致分泌不足。p.Cys247Tyr與p.G240E/p.R248G相鄰，推測p.Cys247Tyr對FⅫ的致病機(jī)制與p.G240E/p.R248G相似。為了進(jìn)一步證明p.Cys247Tyr的致病性，本研究分析了其保守性和可能對蛋白質(zhì)的影響。在同源物種分析中，Cys247是一個高度保守的位點，被認(rèn)為是FⅫ的重要功能位點。在線生物信息學(xué)軟件預(yù)測結(jié)果為“有害突變”和“致病”，可對蛋白質(zhì)功能造成一定影響，并引起相關(guān)疾病。由于FⅫ的Kringle結(jié)構(gòu)域沒有X射線三維結(jié)構(gòu)圖，因此無法分析突變蛋白的空間結(jié)構(gòu)。當(dāng)Cys247被Tyr247取代后，Cys247-Cys271位點間的二硫鍵消失，此外，p.Cys247Tyr在側(cè)鏈中引入了一個大的酪氨酸芳環(huán)，這可能會形成其他分子間作用力，如氫鍵和空間位阻等。這些都可能影響蛋白質(zhì)的正常結(jié)構(gòu)，形成不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，更容易被降解，從而引起了FⅫ水平降低。

除c.797G>A和c.1681G>A突變外，本研究中先證者第1外顯子啟動子區(qū)存在46C/T多態(tài)性。C>T取代后，在起始密碼子上游的4個堿基處形成新的起始密碼子，導(dǎo)致起始密碼子下游第7個堿基處形成終止密碼子，翻譯提前終止。先證者妻子的FⅫ:C約為先證者的3倍，這與文獻(xiàn)報道的結(jié)論相一致[14]。

到目前為止，人類基因突變數(shù)據(jù)庫(HGMD)中已經(jīng)登記了58個FⅫ突變，Kringle域的突變很少。本文首次報道的c.797G>A豐富了數(shù)據(jù)庫。我們發(fā)現(xiàn)先證者APTT的顯著延長(179.2s)以及FⅫ活性的顯著減低(FⅫ:C為1%)可能是由46T/T、c.797G>A和c.1681G>A復(fù)合雜合突變共同引起，導(dǎo)致FⅫ缺乏的發(fā)生。