分子生物學技術在感染性疾病診斷中的應用進展

呂晶南，余方友

(1. 蘇州大學第二附屬醫院檢驗科，江蘇蘇州215004；2. 同濟大學附屬上海市肺科醫院檢驗科，上海 200082)

2019新型冠狀病毒(2019-nCoV)的暴發，使分子生物學技術在臨床感染性疾病診斷、治療、療效評價及預防等方面得到前所未有的重視和飛速發展。本文就近年來基于核酸檢測技術鑒定病原體進行系統化討論，同時也對這些方法在臨床實驗室應用時可能遇到的挑戰和機遇進行闡述。

1 呼吸道感染

1.1病毒 呼吸道病毒的感染對全球流行病公共衛生可引起嚴重的威脅，如1918年甲型流感大流行，2003年嚴重急性呼吸系統綜合征(SARS)冠狀病毒暴發，2009年甲型H1N1流感引起的大流行，2012年阿拉伯半島出現由冠狀病毒引起的中東呼吸綜合征(MERS)，2019年2019-nCoV的暴發。值得注意的是，僅基于體征和癥狀區分病毒來源較困難，同時不同病毒感染采取的治療方案不同，因此，呼吸道病毒對人類健康構成嚴重威脅[1]。目前，食品藥品監督管理局(Food and Drug Administration,FDA)批準的多重呼吸道病毒組合能夠檢測多達20種不同的病毒靶標[2]。

Luminex xMAP檢測是一種基于多重RT-PCR的檢測方法，采用多色熒光標記的微球(珠)雜交，可同時檢測和鑒定12種呼吸道病毒和亞型[2]：首先通過多重RT-PCR擴增病毒的保守區域，然后通過含有生物素的脫氧核苷酸延伸反應，擴增產物被生物素標記，與顏色編碼微球上的病毒特異性探針進行雜交，檢測熒光信號。

Verigene系統(Nanosphere公司)通過PCR擴增結合納米金顆粒標記的探針，與排列在載玻片上的捕獲寡核苷酸靶序列進行雜交。探針捕獲目標片段后，信號隨即放大。FDA已批準Verigene系統用于檢測甲型流感病毒、甲型流感病毒H3亞型、甲型流感病毒2009 H1N1亞型、乙型流感病毒和呼吸道合胞病毒(RSV)A和B亞型[3]。該系統已開發出用于檢測13種病毒和3種細菌靶標的多重呼吸道檢測組合(部分見表1)。

FilmArray用于同時檢測和鑒定17種病毒和3種細菌呼吸道病原體(部分見表1)：使用多重兩步RT-PCR，對靶擴增子進行高分辨率熔解曲線分析，以檢測每種組合中的分析物[4]。該系統完全封閉，因此不會出現交叉污染。

eSensor系統采用基于電化學檢測的DNA微陣列技術，基于夾心測定原理，可檢測14種不同類型和亞型的呼吸道病毒(部分見表1)[5]。由于該檢測需要對樣品進行PCR后處理，因此必須注意避免由擴增子交叉污染引起的假陽性。

1.2百日咳鮑特菌(Bordetellapertussis) 鮑特菌屬中有4種可引起人類呼吸系統疾病：百日咳鮑特菌、副百日咳鮑特菌、支氣管敗血鮑特菌、霍氏鮑特菌。百日咳是由百日咳鮑特菌引起的高度傳染性呼吸道疾病。高達20%的副百日咳鮑特菌感染可能引起百日咳樣疾病，更常見于幼兒[6]。支氣管敗血鮑特菌常發生在免疫受損的個體中，常有牲畜接觸史[7]。霍氏鮑特菌是最近發現的與人類百日咳樣疾病相關的病原微生物[8]。鮑特菌屬4個種都在人類呼吸道疾病中發揮重要作用[9]。

表1 FDA批準的檢測呼吸道病毒組合參數

分子檢測(nucleic acid amplification tests，NAATs)可有效用于鮑特菌屬間的鑒別[9]。通過檢測多拷貝插入序列(insertion sequence，IS)來提高特異性。IS481是百日咳鮑特菌最有效的多拷貝靶點，也可見于霍姆鮑特菌及支氣管膿毒鮑特菌。因此，以IS481作為唯一的靶位來檢測百日咳鮑特菌存在一定的局限性，特別是在暴發流行中，會出現假陽性。IS1002見于百日咳鮑特菌和副百日咳鮑特菌，而霍姆鮑特菌或支氣管膿毒鮑特菌中不存在IS1002。IS1001見于副百日咳鮑特菌以及支氣管膿毒鮑特菌。針對上述3種ISs多拷貝靶點的組合可鑒別感染相關的鮑特菌屬。百日咳毒素啟動子區域(pertussis toxin operon, PT)常用于檢測百日咳鮑特菌。該靶點同時見于副百日咳鮑特菌和支氣管膿毒鮑特菌中，但在這2種菌中由于啟動子區域存在突變，導致該蛋白質不表達。總之，通過增加特異性擴增靶點(如采用雙重或三重PCR方法)可提高NAATs檢測百日咳鮑特菌的檢出率[9]。

1.3結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis) 目前，FDA批準2種NAATs可用于直接檢測臨床標本中的結核分枝桿菌，分別是結核分枝桿菌擴增直接檢測試劑(MTD檢測，Hologic/Gen-Probe)和Xpert MTB/RIF試劑(Cepheid公司)。MTD檢測基于轉錄介導的核糖體RNA擴增，可用于檢測抗酸桿菌涂片陽性和涂片陰性呼吸道標本。Xpert MTB/RIF使用半巢式實時定量PCR檢測痰標本中結核分枝桿菌的DNA以及與利福平耐藥性相關的突變基因rpoB。該檢測系統使用一次性檢測盒，GeneXpert儀器可自動進行核酸提取、擴增及檢測，敏感性為95%，特異性為99%[10]。

2 中樞神經系統感染

1型和2型單純皰疹病毒(herpes simplex virus, HSV)可引起各種臨床綜合征，包括皮膚黏膜、眼睛、中樞神經系統以及生殖系統的感染。其中引起的腦炎臨床癥狀與其他病毒引起的腦炎，如西尼羅河病毒、圣路易斯腦炎病毒和東部馬腦炎病毒引起的腦炎，臨床癥狀比較相似，不易區分。細胞培養或活檢是診斷HSV腦炎的金標準。腦脊液(CSF)培養對成人HSV腦炎的診斷敏感性低于10%。檢測CSF中HSV抗原或抗體的敏感性和特異性分別為75%～85%和60%～90%[11]。由于傳統方法的局限性，高敏感性檢測腦炎患者腦脊液中HSV DNA的方法得到廣泛關注，其中也包括二代測序技術(next-generation sequencing,NGS)[12]。

FDA已經批準了幾種用于檢測生殖道標本中HSV DNA的商品化試劑，但對于腦脊液樣本FDA僅批準了1種，即Simplexa HSV 1和2 Direct Kit(Focus Diagnostics公司)。該試劑提供作為分析物特異性試劑(analyte-specific reagents，ASRs)的引物和探針，使用實驗室自建檢測方法(laboratory developed tests, LDT)檢測系統進行檢測。檢測HSV DNA的靶點包括：編碼聚合酶，糖蛋白B，糖蛋白D或胸苷激酶的基因。這些靶點應具有特異性，即引物不能擴增與神經系統疾病相關的其他皰疹病毒的DNA，如巨細胞病毒、水痘帶狀皰疹病毒、6型人皰疹病毒和愛潑斯坦-巴爾病毒。宏基因組二代測序(metagenome next-generation sequencing,mNGS)能夠用較少的樣本量，通過其高通量、深度測序的特點快速、準確地檢測感染相關的病原體。2020年Osterman等[13]應用 mNGS對1例48歲疑似病毒性腦炎患者的腦脊液進行了檢測，結果發現該重癥患者感染1型人類皰疹病毒(HHV-1)。mNGS不僅可以快速準確地檢測出常見的病原體， 同時也可對病原體進行定量研究。Liu等[12]應用mNGS診斷出1例患有HSV腦炎的1歲患兒，經阿昔洛韋治療后，癥狀消失，同時檢測患兒腦脊液中HSV1 DNA定量從4 290下降至0。研究表明，腦脊液 mNGS對常見的皰疹病毒感染的腦炎確診以及治療效果的評估具有重要的臨床價值。

3 血流感染

目前已有多種基于核酸擴增的方法，可有效縮短鑒定血培養中病原菌所需的時間。其中FDA批準的檢測方法包括肽核酸熒光原位雜交(peptide nucleic acid-fluorescence in situ hybridization，PNA FISH)、RT-PCR以及基于巢式PCR的血培養鑒定板[14]。

PNA FISH探針是一種DNA探針，其中帶負電荷的糖磷酸骨架被帶中性電荷的肽骨架取代。這種中性電荷結構使探針與靶核酸結合時不存在靜電排斥作用，因此雜交更加緊密、快速[15]。該技術可用于快速鑒定金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性葡萄球菌、腸球菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌及念珠菌(包括白念珠菌、近平滑念珠菌、熱帶假絲酵母、光滑念珠菌和克柔念珠菌)，操作簡便，30 min后通過熒光顯微鏡觀察結果。

對疑似金黃色葡萄球菌感染的菌血癥患者，萬古霉素是標準治療方案。因為在大多數臨床微生物實驗室，50%或更多分離的菌株為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)；然而，萬古霉素對甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌(methicillin sensitiveStaphylococcusaureus，MSSA)的效果不及甲氧西林。因此，在血流感染中快速鑒別MRSA和MSSA十分重要。Xpert MRSA/SA BC(Cepheid公司)和GeneOhm StaphSR (BD Diagnostics公司)是FDA批準的2種real-time PCR試劑盒，可直接用于鑒別陽性血培養中的MRSA和MSSA[16-17]。

Verigene革蘭陽性和革蘭陰性細菌鑒定板(Nanosphere公司)以及FilmArray血培養鑒定(BCID)系統(BioFire Diagnostics公司)可直接檢測血培養中病原微生物[18-20]。

FilmArray BCID可同時在一塊板上聯合檢測包括革蘭陽性細菌、革蘭陰性細菌以及多種酵母菌在內的24種病原菌和3種抗菌藥物耐藥基因。該鑒定板可以鑒定出陽性血培養中80%～90%病原微生物，并檢測對甲氧西林耐藥的葡萄球菌，對萬古霉素耐藥的腸球菌以及產碳青霉烯酶的革蘭陰性腸桿菌科細菌[20]。

Verigene BCID系統采用納米金基因芯片法可直接從陽性培養瓶中鑒定病原微生物，不需要進行核酸擴增[18]。當血培養瓶出現陽性報警時，根據革蘭染色結果選擇不同的血培養鑒定板。Verigene革蘭陽性菌血培養鑒定板已被批準測定12個屬或種的細菌以及3種耐藥基因。Verigene革蘭陰性菌血培養鑒定板可以在2.5 h內檢測8個屬或種和9個耐藥基因。革蘭陽性菌血培養鑒定板可以檢測mecA、vanA和vanB基因，革蘭陰性菌血培養鑒定板可以檢測6種不同的β-內酰胺酶基因。檢測真菌的Verigene鑒定板正在開發中，該鑒定板可以檢測白念珠菌、杜氏假絲酵母、光滑念珠菌、克魯斯念珠菌、近平滑念珠菌、熱帶假絲酵母、隱球菌和新型隱球菌[21-22]。

基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)通過使用蛋白質組學對病原體進行鑒定。陽性的血培養瓶中的病原體可直接應用該方法進行鑒定[23]。

二代測序可在血液中檢測出大量非致病微生物序列，同時現有研究尚未給出單純基于測序結果判斷污染菌或致病菌的標準，因此對測序結果的判讀常需結合臨床綜合判斷。

4 胃腸道感染

腸道病毒(Enterovirus，EV)是一組屬于微核糖核酸科的單鏈RNA病毒。目前，人類腸道病毒被分為7個種類。EV感染的診斷通常基于臨床表現和NAATs。

目前，有2種腦脊液EV檢測試劑盒通過了FDA的認證，分別是：NucliSENS EasyQ(bioMérieux公司)和Xpert EV(Cepheid公司)[24]。但是，NucliSENS Easy Q EV試劑盒不能通過商業渠道獲得。Xpert EV的敏感性為97%，特異性達100%[25-26]，且操作簡單，經過自動化的核酸提取、擴增和檢測，2.5 h內即可出檢測結果。

艱難梭菌(Clostridiumdifficile)是一種革蘭陽性產芽胞厭氧桿菌，定植后可引起腹瀉等癥狀。抗菌藥物的使用導致腸道菌群紊亂，有助于該菌在腸道中定植。目前，已有15種不同的檢測平臺獲得了FDA批準，包括實時PCR、環介導擴增、解旋酶依賴性擴增和基因芯片技術等多種不同方法。通過檢測多種靶基因，包括tcdA、tcdB、tcdA和tcdC，其中后兩者可以用于鑒定核糖體型027菌株[27-28]。

傳染性胃腸炎(infectious gastroenteritis, IGE)是全球發病率和死亡率的主要原因。在美國，每年大約發生1.788億例IGE，其中有474 000例患者接受住院治療以及5 000例患者死亡[11,29]。常見的檢測方法，包括抗原檢測、培養、蟲卵和寄生蟲的顯微鏡檢查，以及單靶位點的NAATs，都用來檢測與IGE有關的病原體或毒素。此外，診斷方法的選擇需要根據患者的年齡、疾病嚴重程度、免疫功能低下狀態、腹瀉的持續時間和類型、旅行史和患病季節時間來決定[30]。通常來說，由于臨床醫生對每種診斷方法的適用范圍不夠了解，因此可能會漏檢[31]。 FDA已經批準了5個用于檢測腸道病原體組的試劑盒。

Prodesse ProGrastro SSCS(Hologic/Gen-Probe)使用實時熒光定量PCR技術檢測鑒定沙門菌屬、志賀菌屬和彎曲桿菌屬，同時可以在不同大腸埃希菌的混合物中鑒別產志賀毒素1(stx1)和志賀毒素2(stx2)2種大腸埃希菌[32]。

BD MAX EBP使用單個實時熒光定量PCR來檢測病原體和毒素，包括：志賀菌屬、腸道侵襲性大腸埃希菌、彎曲桿菌屬以及毒素stx1/stx2。與Prodesse ProGrastro SSCS分析不同的是，BD MAX可以自動完成從樣品制備到靶基因擴增和檢測的所有步驟[32-33]。

Luminex xTAG GPP通過多重PCR技術和液珠陣列檢測包括彎曲桿菌屬、艱難梭菌、大腸埃希菌O157、產腸毒素大腸埃希菌、沙門菌屬、志賀菌屬、霍亂弧菌、腺病毒40/41、諾如病毒GⅠ/GⅡ、輪狀病毒A、隱孢子蟲屬、溶組織內阿米巴和賈第鞭毛蟲[34]。雖然該系統檢測通量高，但仍需手工進行核酸提取，這樣增加交叉污染，引起假陽性。另外，該系統耗時較長。

多重PCR技術和金納米顆粒微陣列可用于檢測5種細菌、2種毒素和2種病毒，包括Verigene彎曲桿菌屬、沙門菌屬、志賀菌屬、弧菌屬、小腸結腸炎耶爾森菌、stx1、stx2、諾如病毒和輪狀病毒[35]。這是一個簡單易用的一體化的檢測系統，但因為一次只能運行一個樣本，所以其輸入輸出量有限。

Film Array通過多重PCR技術和熔解曲線可同時檢測12種細菌、5種病毒和4種原蟲，包括彎曲桿菌屬、艱難梭菌毒素A/B、類志賀鄰單胞菌屬、沙門菌屬、弧菌屬、霍亂弧菌、小腸結腸炎耶爾森菌、腸道聚集大腸埃希菌、腸致病性大腸埃希菌、產腸毒素大腸埃希菌、產志賀樣毒素大腸埃希菌、大腸埃希菌O157、腺病毒F 40/41、星狀病毒、諾如病毒GⅠ/GⅡ、輪狀病毒A、沙波病毒、隱孢子蟲屬、環孢子蟲、溶組織內阿米巴和藍氏賈第鞭毛蟲[36]。這是目前檢測病原體較全面的方法。與所有Film Array產品類似，使用簡單，可在約1 h內提供檢測結果，主要的缺點是輸出量低和高成本。

5 結語

每種檢測方法都有不同的優缺點，只有多種分子生物學方法聯合應用，并與傳統培養鑒定相結合，才有助于感染性疾病的診斷。