細胞分裂周期相關蛋白5在肝細胞肝癌中的表達及臨床意義△

李德新，李飛，趙曉晨，李華，李茂德，蘭戴天，安祥

四川省醫學科學院·四川省人民醫院（東院）肝膽胰腺外科，成都 610010

肝細胞肝癌是最常見的消化系統惡性腫瘤之一，病情嚴重、發展迅速，病死率極高。早期肝細胞肝癌患者往往缺乏特異性的臨床癥狀，就診時已處于中晚期，臨床預后較差。目前，早期肝細胞肝癌患者主要采取根治性手術治療，中晚期或復發轉移性干細胞肝癌患者主要采用全身治療（如靶向治療）+局部治療（手術、消融、放療、經導管動脈栓塞化療等），但治療效果并不理想。探討肝細胞癌的形成機制，尋找關鍵的治療靶點，對肝細胞肝癌的治療有重要意義。細胞分裂周期相關蛋白 5（cell division cycle associated 5，CDCA5）基因屬于肝癌數量性狀位點（quantitative trait locus，QTL）熱點區域基因，其相對表達量及在細胞的定位隨細胞周期不同而變化，能夠調節細胞周期相關蛋白和轉錄因子的表達，參與細胞增殖分化。研究顯示，CDCA5在多種腫瘤組織中高表達，可以與細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）共同作用，調控腫瘤細胞的增殖。細胞周期蛋白依賴性激酶1（cyclin dependent kinase 1，CDK1）、細胞周期蛋白 B1（cyclin B1）是調節細胞周期的相關蛋白，其復合物有絲分裂促進因子在細胞周期G/M期中發揮重要作用，不同的CDK-周期蛋白質復合物可促進特異性的靶蛋白質磷酸化而激發細胞周期各期的順利進行，CDK通過調節靶蛋白磷酸化而調控細胞周期的運轉。因此，本研究通過檢測CDCA5和ERK在肝細胞肝癌組織中的表達，分析其作用機制，旨在明確CDCA5在肝細胞肝癌治療中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月至2019年1月四川省人民醫院肝膽外科收治的原發性肝細胞肝癌患者。納入標準：手術病理學檢查確診為肝細胞肝癌；術前均未接受過放化療治療；臨床資料及隨訪資料完整。排除標準：合并轉移性肝癌或其他惡性腫瘤；合并急性嚴重感染、明顯肝腎功能不全；合并血液系統疾病或自身免疫系統疾病；無法耐受手術治療。依據納入和排除標準，本研究共納入260例肝細胞肝癌患者，其中男174例，女86例；年齡25～75歲，平均（51.34±11.25）歲；腫瘤直徑≤5 cm 121例，＞5 cm 139例；Edmondson分級：Ⅰ級41例，Ⅱ級83例，Ⅲ級72例，Ⅳ級64例；巴塞羅那臨床肝癌（Barcelona clinic liver cancer，BCLC）分期：0期47例，A期80例，B期77例，C期56例；合并門靜脈癌栓118例，未合并門靜脈癌栓142例；甲胎蛋白（α-fetal protein，AFP）水平：≥400 ng/ml 164例，＜400 ng/ml 96例。同期選取52例肝臟良性病變患者作為對照，其中男35例，女17例；年齡26～75歲，平均（51.62±11.18）歲。兩組患者性別、年齡比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。取肝細胞肝癌患者的肝癌組織和肝臟良性病變患者的正常肝組織。

1.2 實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription- polymerase chain reaction，RTPCR）測定CDCA5、ERK mRNA的相對表達量

取肝細胞肝癌患者的肝癌組織和肝臟良性病變患者的正常肝組織，采用實時熒光定量RT-PCR測定CDCA5、ERK mRNA在肝細胞肝癌組織中的相對表達量，勻漿后，Trizol法提取組織總RNA，總RNA經反轉錄合成cDNA，進行實時RT-PCR，以GAPDH作為內參。

1.3 蛋白質印跡法（Western blot）檢測CDCA5、ERK、CDK1、cyclin B1蛋白的相對表達量

無菌取肝細胞肝癌組織或正常肝組織約50 mg，研磨提取總蛋白，采用Bradford法進行蛋白質定量，將提取的總蛋白（50 μg）樣品經過聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，加入5%脫脂牛奶封閉后，加入CDCA5、ERK、CDK1、cyclin B1抗體，4 ℃孵育過夜后加入二抗，37℃孵育2 h，電化學發光（electrochemiluminescence，ECL）檢測，以β-actin為內參，采用Photoshop圖像分析軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 CDCA5、ERK mRNA相對表達量的比較

肝細胞肝癌組織中CDCA5、ERK mRNA的相對表達量分別為（0.81±0.10）、（0.92±0.07），均高于正常肝組織的（0.63±0.03）、（0.54±0.11），差異均有統計學意義（t=2.210、3.652，P＜0.05）。

2.2 CDCA5、ERK、CDK1和cyclin B1蛋白相對表達量的比較

肝細胞肝癌組織中CDCA5、ERK、CDK1和cyclin B1蛋白的相對表達量均高于正常肝組織，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表1）

表1 不同組織中CDCA5、ERK、CDK1和cyclin B1蛋白相對表達量的比較（±s）

2.3 不同臨床特征肝細胞肝癌患者肝細胞肝癌組織中CDCA5和ERK mRNA相對表達量的比較

不同年齡、性別肝細胞肝癌患者肝細胞肝癌組織中CDCA5、ERK mRNA的相對表達量比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。不同腫瘤直徑、Edmondson分級、BCLC分期、合并門靜脈癌栓情況和AFP水平肝細胞肝癌患者肝細胞肝癌組織中CDCA5、ERK mRNA的相對表達量比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征肝細胞肝癌患者肝細胞肝癌組織中CDCA5和ERK mRNA的相對表達量（n=260）

2.4 CDCA5和ERK的表達與肝細胞肝癌患者臨床特征的相關性

CDCA5、ERK的表達與Edmondson分級為Ⅲ～Ⅳ級、BCLC分期為B～C期、有門靜脈癌栓和AFP水平升高呈正相關（P＜0.05）。（表3）

表3 CDCA5和ERK的表達與肝細胞肝癌患者臨床特征的相關性

3 討論

原發性肝細胞肝癌是中國常見的惡性腫瘤之一，病因和發病機制尚未明確，臨床主要采取手術治療，但術后復發率較高，預后較差。本研究結果顯示，CDCA5和ERK在肝細胞肝癌組織中的相對表達量較高，表明CDCA5和ERK的異常高表達可能與肝細胞肝癌的發病有關。ERK包括ERK1和ERK2，磷酸化的ERK1/ERK2可以將信號從表面受體傳導至細胞核，啟動下游靶基因的轉錄，參與調控細胞骨架的構建、細胞增殖、分化、凋亡及細胞癌變等多種生物學行為。CDCA5可以通過促進姐妹染色單體在細胞周期S期和G/M期穩定結合介導DNA的重組修復，還可以保證姐妹染色單體在有絲分裂后期準確分離，參與了細胞分裂、增殖及凋亡的整個過程。Tokuzen等的研究發現，CDCA5包含ERK和CDK1/cyclin B1的磷酸化位點，其中ERK2磷酸化CDCA的5位點為S79和S209，CDK1/cyclin B1磷酸化CDCA5的位點為S21、S75 和 T159。陳墅圳等研究發現，CDCA5可能依賴ERK的磷酸化來發揮促癌作用，ERK在傳導細胞外信號的過程中，進入細胞核，磷酸化CDCA5通過調節細胞周期相關蛋白，調節細胞增殖過程。Shen等的研究發現，CDCA5在肝癌組織中高表達，且CDCA5基因沉默會抑制CDK1和cyclin B1的表達，抑制細胞增殖。本研究結果顯示，肝細胞肝癌組織中CDK1、cyclin B1的相對表達量均明顯上調，與上述研究一致，CDK1和cyclin B1是細胞周期的相關調節蛋白，其復合物有絲分裂促進因子在細胞周期向G/M期進展中發揮重要作用，表明CDCA5可能通過促進CDK1、cyclin B1的表達，促進細胞周期向G/M期轉變，促進有絲分裂，促進腫瘤細胞惡性增殖，有望作為肝細胞肝癌臨床治療的新靶點。

目前，臨床缺乏有效的治療手段來治療肝細胞肝癌，尋找新的治療靶點、正確評估患者的病情，有助于延長患者的無病生存期。臨床根據腫瘤直徑、Edmondson分級、BCLC分期及門靜脈癌栓等評估病情嚴重程度。本研究結果顯示，CDCA5、ERK的表達與Edmondson分級為Ⅲ～Ⅳ級、BCLC分期為B～C期、有門靜脈癌栓和AFP水平升高呈正相關（P＜0.05）。黃維甄等的研究顯示，病理分級、BCLC分期及門靜脈栓情況與肝細胞肝癌患者的預后密切相關，病理分級為Ⅲ～Ⅳ級或BCLC分期為B～C期、合并門靜脈癌栓或AFP水平升高患者的生存期明顯縮短、生存率明顯下降，與本研究結果一致。表明CDCA5的表達與肝細胞肝癌患者的病情發展相關，可以反映其病情嚴重程度，臨床可根據CDCA5的相對表達量來評估疾病惡性程度，調整治療方案，可提高患者的預后。

綜上所述，CDCA5和ERK在肝細胞肝癌組織中的表達明顯上調，其表達與Edmondson分級為Ⅲ～Ⅳ級、BCLC分期為B～C期、有門靜脈癌栓和AFP水平升高呈正相關，CDCA5可能依賴ERK的磷酸化來促進CDK1、cyclin B1的表達，促進細胞周期向G/M期轉變，促進細胞有絲分裂，促進腫瘤細胞惡性增殖。但CDCA5和ERK作用于肝細胞肝癌的具體機制尚有待進一步研究。但本研究納入的樣本量較少，可能會對結果產生一定誤差，但本研究為臨床肝細胞肝癌的治療提供了新的思路。