劉坤，楊勇，付鳳蓮，王羽豐，楊梅，魯鳳麗

昆明醫科大學第三附屬醫院/云南省腫瘤醫院1干療科，2泌尿科，昆明 650118

卵巢癌是婦科常見的惡性腫瘤之一，僅次于宮頸癌和宮體癌，但病死率卻居婦科腫瘤的首位。2018年全球有295 000例新病例和184 000例死亡病例。由于卵巢深居盆腔，體積小，缺乏典型癥狀，難以早期發現。大多數卵巢癌就診時已為晚期，缺乏有效的根治方法，含鉑方案化療是主要的治療手段，但易復發，5年生存率不足30%，患者一旦發生鉑耐藥，腫瘤細胞的生長及侵襲速度加快，死亡風險增加。鉑類藥物化療耐藥是治療卵巢癌的主要障礙，嚴重影響卵巢癌患者的治療效果及預后。因此，探討鉑耐藥發生的潛在機制，研究卵巢癌耐藥評估的方法對于提高卵巢癌的治愈率有重要的意義。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）家族是生長因子超家族信號轉導過程中的重要分子，可被多種細胞因子和理化因素激活，激活的PI3K促使蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）蛋白活化。活化的AKT通過磷酸化多種酶、激酶和轉錄因子等下游因子，進而調節細胞的功能（包括代謝、生長、增殖、存活、轉錄以及蛋白質合成）。AKT主要負責由PI3K始動的生物信息的轉導，處于PI3K/AKT信號通路的中心環節，在細胞代謝、細胞周期調控以及生長凋亡等多種生物學過程中發揮著重要作用。正因為PI3K/AKT通路在腫瘤的發生、發展和治療等方面都有著巨大潛力，其近年來也成為生物科學界的研究熱點。有研究表明PI3K/AKT通路通過多種機制誘導腫瘤的發生；也有研究表明PI3K/AKT信號通路的激活有可能與人上皮性卵巢癌鉑耐藥的產生密切相關。本研究通過檢測上皮性卵巢癌鉑類敏感與鉑類耐藥患者血清中PI3K/AKT和基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）的水平，進一步分析其在耐藥組內不同臨床特征患者血清中的表達差異，探討PI3K、AKT及MMP9的表達與鉑耐藥上皮性卵巢癌的關系和相關機制，為臨床早期判斷卵巢癌耐藥提供相關的參考指標，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2015年9月至2018年9月在云南省腫瘤醫院就診的上皮性卵巢癌患者的病歷資料。納入標準：均為晚期卵巢癌；生存期≥3個月；腫瘤細胞減滅術后病理學檢查確診為上皮性卵巢癌；術后均采用以鉑類為基礎的聯合化療。排除標準：有化療禁忌證或不愿意接受化療；合并嚴重感染、嚴重精神障礙、神經系統疾病；接受過PI3K抑制劑等臨床試驗。根據納入、排除標準，共納入78例上皮性卵巢癌患者，按照2018年美國國立綜合癌癥網絡（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）卵巢癌指南定義分為卵巢癌鉑耐藥組（n=40）和鉑敏感組（n=38），其中鉑敏感組定義為初期采用以鉑類為基礎的化療獲臨床緩解（臨床癥狀消失，盆腔檢查和B超檢查均無包塊，血清糖類抗原125值下降至正常），停藥超過6個月未出現復發；鉑耐藥組定義為初期采用以鉑類為基礎的化療達到臨床緩解，但完成化療后，在相對較短的時間內（即6個月之內）出現復發。鉑耐藥組中，年齡38～72歲，平均（51.70±7.18）歲；鉑敏感組中，年齡32～79歲，平均（52.67±9.23）歲；兩組患者年齡、臨床分期、病理類型、組織學分級、淋巴結轉移及脈管浸潤情況比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）（表1）。

表1 鉑敏感組與鉑耐藥組患者的臨床特征[n（%）]*

1.2 方法

1.2.1 治療方法 所有患者采用以鉑類為基礎的聯合化療6～8個療程，直至疾病進展。

1.2.2 血清采集 清晨空腹采集治療前患者的外周靜脈血6 ml，靜置0.5～1.0 h，在5000 r/min離心機下離心15 min，分離新鮮血清，取上清液，分裝于-20℃冰箱保存，分批待檢測。采用酶聯免疫吸附法，嚴格按照試劑盒說明書步驟分別進行PI3K、AKT及MMP9的檢測。每2個周期化療結束后兩周，通過CT等檢查評價療效。

1.2.3 療效評價標準 所有入選患者均接受含鉑方案化療，治療前后進行全面檢查以評價治療效果。采用實體瘤療效評價標準（response evaluation criteria in solid tumor，RECIST）進行療效評價。分為完全緩解（CR）、部分緩解（PR）、疾病穩定（SD）和疾病進展（PD）。CR：所有目標病灶消失；PR：基線病灶長徑總和縮小≥30%；PD：基線病灶長徑總和增加≥20%或出現新病灶；SD：基線病灶長徑總和有縮小但未達到PR，或有增加但未達PD。CR、PR、SD均視為治療有效，PD則視為治療無效。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 PI3K、AKT與MMP9表達水平的比較

鉑耐藥組患者血清PI3K、AKT、MMP9水平均高于鉑敏感組，差異均有統計學意義（t=2.78、2.16、2.23，P＜0.05）。（表2）

表2 兩組患者血清PI3K、AKT與MMP9水平（±s）

2.2 不同臨床特征鉑耐藥組患者血清PI3K、AKT和MMP9水平的比較

不同臨床分期及有無淋巴結轉移、脈管浸潤的鉑耐藥組患者血清PI3K、AKT水平比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；組織學分級為G級、病理類型為透明細胞癌的鉑耐藥組患者血清PI3K及AKT水平分別高于組織學分級為G級及其他病理類型，差異均有統計學意義（P＜0.05）；臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移以及有脈管浸潤的鉑耐藥組患者血清MMP9水平分別高于臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移以及無脈管浸潤患者，差異均有統計學意義（P＜0.05）；不同組織學分級、病理類型的鉑耐藥組患者血清MMP9水平比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（表3）

表3 不同臨床特征的鉑耐藥組患者血清PI3K、AKT和MMP9水平（n=40）

2.3 血清PI3K、AKT、MMP9在鉑耐藥上皮性卵巢癌中的相關性

Spearman相關性分析顯示，40例鉑耐藥上皮性卵巢癌患者外周血清中，PI3K與AKT表達呈正相關（r=0.472，P＜0.05），PI3K與MMP9表達無相關性（r=0.187，P＞0.05），AKT與MMP9表達呈正相關（r=0.431，P＜0.05）。

3 討論

鉑耐藥一直是嚴重影響卵巢癌患者治療效果和預后的幕后黑手。既可以是原發性鉑耐藥，也可能是繼發性鉑耐藥，如果能發現潛在標志物可早期預測、分析鉑耐藥的發生機制，可能會提高卵巢癌患者的治療有效率，延長患者總生存期。近幾年，卵巢癌鉑耐藥的探索一直是研究的熱點，從細胞信號轉導到細胞內轉運蛋白表達異常，從相關染色體變化、DNA修復基因改變、凋亡蛋白抑制因子的出現、谷胱甘肽S轉移酶解毒作用增加，以及腫瘤細胞與細胞外基質的黏附和黏附能力的改變，從而引起細胞骨架重排、蛋白激活表達等均可能成為鉑耐藥的發病機制。

順鉑是治療上皮性卵巢癌的常用藥物，無論在輔助治療還是姑息治療階段，其細胞毒作用主要通過形成鉑-DNA絡合物，破壞DNA結構，導致DNA損傷，誘導腫瘤細胞凋亡。細胞信號轉導通路在鉑耐藥的發生機制中起到了非常明顯的作用。鉑-DNA絡合物引發細胞中DNA損傷，導致細胞中相關信號轉導通路被激活或者被抑制時，細胞的凋亡程序受到抑制，進而表現出對鉑類化療藥物無反應，發生鉑耐藥或鉑抵抗。

PI3K/AKT作為細胞內重要信號轉導通路之一，參與很多重要的生物學過程的調控，其通過影響下游多種效應分子的活化狀態，在細胞內發揮著抑制凋亡、促進增殖的關鍵作用，并且此通路在腫瘤對放療的抵抗、腫瘤細胞的發生與增殖以及侵襲與轉移中關系密切。

MMP9是基質金屬蛋白酶家族中的重要成員，能有效降解細胞外基質中的各種蛋白成分及基底膜中的Ⅳ型膠原纖維，破壞阻止腫瘤細胞侵襲轉移的組織學屏障，從而引起細胞骨架重排、蛋白激活表達，在腫瘤細胞的侵襲轉移以及鉑耐藥中起決定性作用。

有研究認為，鉑耐藥的發生與腫瘤細胞的信號轉導密切相關。順鉑可以通過激活多種信號轉導途徑，激活凋亡信號引起DNA損傷，當信號轉導被抑制時，細胞凋亡被抑制，表現出鉑耐藥或鉑抵抗。還有研究表明，順鉑能夠在多種腫瘤細胞中激活PI3K/AKT信號通路，使AKT下游蛋白磷酸化，PI3K抑制劑可以阻斷這些現象，提高細胞對順鉑的敏感性。本研究發現上皮性卵巢癌鉑耐藥組患者血清PI3K、AKT水平均高于鉑敏感組，進一步證實了PI3K/AKT信號通路在上皮性卵巢癌鉑耐藥中的作用。卵巢透明細胞癌是卵巢癌中惡性度較高的，也經常出現鉑類藥物耐藥性的產生，且卵巢透明細胞癌中存在高頻率的磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶催化亞基α（phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunitalpha，PIK3CA）突變，運用PIK3CA基因靶向藥物可能會對耐藥透明細胞癌的治療提供新的治療方案。本研究也發現，在鉑耐藥組上皮性卵巢癌患者中，不同病理類型患者的PI3K及AKT水平不一樣，其中透明細胞癌患者血清中PI3K及AKT水平高于其他病理類型的卵巢癌；組織學分級為G級的患者血清PI3K及AKT表達水平高于G級患者；研究還發現上皮性卵巢癌鉑耐藥組患者血清MMP9水平高于鉑敏感組，表達水平在臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移及有脈管浸潤患者中升高。進一步相關性分析顯示，40例鉑耐藥上皮性卵巢癌患者外周血清中，PI3K與AKT表達呈正相關（r=0.472，P＜0.05），AKT與MMP9表達呈正相關（r=0.431，P＜0.05）。結果表明，PI3K/AKT信號通路在上皮性卵巢癌鉑耐藥中起著重要作用，活化的AKT通過激活下游靶蛋白如MMP9等抑制細胞凋亡，降低細胞對化療藥物的敏感性。

綜上所述，PI3K、AKT及MMP9在鉑耐藥上皮性卵巢癌患者血清中高表達，且PI3K及AKT的表達水平與組織學分級和病理類型有關，MMP9表達水平與臨床分期和淋巴結轉移、脈管浸潤有關；MMP9表達與AKT表達呈正相關。這些結果在臨床實踐中有著潛在的應用價值，外周血PI3K、AKT及MMP9高表達是否可以作為評估鉑耐藥的參考指標以及化療前外周血PI3K、AKT及MMP9高表達的患者使用非鉑類化療或PI3K抑制劑是否療效更好需要未來的研究去探索，為鉑耐藥卵巢癌患者探索有效的延緩和逆轉耐藥的新策略提供一定的依據。