基于高通量測序的象山港海域黑鯛(Acanthopagrus schlegelii)食性分析

孫 鵬,凌建忠,張 輝,唐保軍,姜亞洲

中國水產科學研究院東海水產研究所,農業農村部東海與遠洋漁業資源開發利用重點實驗室, 上海 200090

黑鯛(Acanthopagrusschlegelii, Bleeker, 1854)隸屬于鱸形目(Perciformes),鯛科(Sparidae)、棘鯛屬(Acanthopagrus),為暖溫性底層魚類,棲息于近岸巖礁海區、內灣以及咸淡水水域,廣泛分布于包括我國沿海在內的西北太平洋溫暖水域[1],為我國東南沿海重要的捕撈品種和增養殖對象[2- 4]。象山港位于我國浙江中部沿海,是一個半封閉性港灣,其自然生態環境優良,是多種漁業資源的集中分布區,也是多種經濟魚類的繁殖、育幼場所[5- 6]。黑鯛是象山港的優勢魚種和重要捕撈對象,在生態系統物質循環和能量流動過程中起著重要作用[7]。近年來,象山港所面臨的人為脅迫日趨嚴重,在此背景下保障黑鯛等重要物種的種群穩定對于該海域具有重要的生態和經濟意義。

魚類基礎生態學研究是制定魚類資源增殖養護策略的科學依據[8]。攝食習性作為基礎生態學的重要研究內容,是了解不同魚類間營養關系的基礎,同時也是探討攝食策略、評估魚類生存狀況和生態系統功能、構建棲息地選擇模型等相關熱點問題的重要依據[9- 12]。食性分析方法的準確性和精確性是影響分析結果應用價值的重要因素[13]。近年來,隨著高通量測序技術的發展,該技術逐漸被應用到野生動物的食性分析中,有效提升了食性分析的效率,拓寬了食性分析的應用范圍,并在數據量、靈敏度和分辨率方面較傳統的食性分析方法顯現出一定的優勢[14]。

針對黑鯛食性研究的薄弱現狀,以象山港采捕黑鯛個體為研究對象,以18S rDNA為靶標,利用Illumina Miseq高通量測序方法探究黑鯛餌料生物組成特征,分析不同齡組黑鯛食性的異同,以期在豐富象山港黑鯛攝食生態學認知的同時,為制定該海域黑鯛資源增殖養護措施提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

實驗所用樣品為2019年3至4月份通過桁桿拖網和流刺網收集于浙江寧波象山港海域的黑鯛漁獲樣本,本次研究共選取其中21尾用于食性分析。為保持樣品新鮮及胃含物不被進一步分解,捕捉后立即使用丁香酚麻醉處死并于現場進行常規生物學測量(體長、體重、性別、胃重、空胃重等),隨即解剖取得胃含物于干冰中保存備用。與此同時,采集矢耳石用于年齡鑒定。參考海洋調查[15]規范將黑鯛漁獲樣品攝食強度分為5級(0級—4級),分別對應空胃、食物不超過胃腔50%、食物超過胃腔50%、食物充滿不膨脹和食物充滿胃腔并且膨脹等五種狀態。對胃飽滿度高的黑鯛個體,將含量較多的食物物種進行單獨稱重,再從其中定量選取一部分與其他含量少的物種一起混合保存于無菌離心管中；對胃飽滿度較低的個體,將所有胃含物一起收集；稱量并記錄離心管中樣品重量；對空胃個體取其胃內粘液進行測序分析。實驗黑鯛樣品的生物學信息如表1所示。

表1 黑鯛樣品基礎生物學信息

1.2 DNA提取

胃含物在實驗室中經磷酸鹽緩沖液(pH 7.2—7.6)沖洗后進行勻漿處理。充分勻漿后的胃含物經定量后采用海洋生物DNA提取試劑盒(北京天根)并參照說明書進行總DNA提取。所得總DNA經0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測,并采用紫外分光光度計定量,隨后于-20℃保存備用。

1.3 Illumina Miseq高通量測序

使用擴增片段約為420 bp的通用引物547F：5′-CCAGCASCYGCGGTAATTCC- 3′和V4R：5′-ACTTTCGTTCTTGATYRA- 3′[16]對18S rDNA V4區域進行擴增。PCR反應在一個20 μL體系中進行,反應體系如下：5×緩沖液4 μL,dNTPs(2.5 mmol/L)2 μL, 正反引物(5 μmol/L)各1 μL,Q5高保真Taq酶(NEB,北京) 0.5 μL,DNA模板10 ng。PCR程序為：95℃預變性7min,95℃變性45 s,55℃退火30 s,72℃延伸45 s,最后72℃延伸10 min,反應循環數為29。PCR擴增產物通過2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測和純化后,在 Illumina Miseq測序平臺(Illumina,美國)進行雙端測序。

1.4 數據分析

下機數據經過初步篩選并去除嵌合體后得到有效數據。應用QIIME軟件對序列按照97%的序列相似度進行歸并和操作分類單元(operational taxonomic units,OTU)劃分,再選擇OTU中的代表性序列與Silva數據庫(http://www.arb-silva.de/)進行物種注釋分析以及黑鯛自身序列剔除,并結合象山港海洋各生態類型水生生物分布信息對所注釋物種進行人工校對[5]。并運用QIIME軟件對所得OTU進行聚類以分析不同樣品胃含物的物種組成。通過OTU分析可得出餌料生物的多樣性和不同物種的相對豐度。

為分析不同齡組黑鯛餌料生物組成的差異,基于上述高通量測序結果,建立“個體×餌料生物相對豐度”矩陣,基于聚類分析對不同齡組黑鯛個體的餌料生物組成進行二維排序,并利用相似性分析檢驗(Analysis of similarities,ANOSIM)檢驗不同齡組黑鯛餌料生物組成差異的顯著性[17-18]。為權衡稀有物種和優勢物種的權重,在進行多元分析前,對原始數據進行了4 次方根轉化[19]。

2 結果

2.1 OTU劃分與分類地位鑒定

經Illumina高通量測序共從21個樣品中獲得長度約為420 bp的目的片段913254條,樣品的序列數目最低為30826條,最高為52374條,平均序列數為(43488±5843)條。21個樣品經過聚類共獲得554個OTU,不同樣品中含有OTU數目差異較大,其OTU劃分和分類地位鑒定結果參見表2。

表2 可操作分類單劃分和分類地位鑒定結果統計表

圖1所示為黑鯛胃含物樣本所含餌料生物相對豐度前20位的分類單元的總體分類等級樹圖。以不同顏色區分各分類單元,并通過節點大小反映它們的相對豐度分布,可直觀反應黑鯛餌料生物的優勢類群。本研究利用高通量測序方法共在黑鯛胃含物中鑒定出9個門類的62種餌料生物,這些餌料生物分屬于41個屬。其中,軟體動物門(Mollusca)、節肢動物門(Arthropoda)和綠藻門(Chlorophyta)的相對豐度較高,其次是脊索動物門(Chordata)、扁形動物門(Platyhelminthes)、硅藻門(Bacillariophyta)和環節動物門(Annelida),線蟲動物門(Nematoda)的相對豐度較低,此外還有部分OTU未能歸屬到已知分類單元。

圖1 黑鯛餌料生物的總體分類等級樹Fig.1 General classification tree of prey items for the black sea bream

2.2 黑鯛餌料生物組成

表3列舉了相對豐度排序前20位的黑鯛餌料生物種類。從餌料生物出現頻率和相對豐度分析,石莼(Ulvalactuca)、熊本牡蠣(Crassostreasikamea)、胸刺水蚤(Centropageshamatus)、日本蟳(Charybdisjaponica)、毛蚶(Scapharcasubcrenata)和褐菖鲉(Sebastiscusmarmoratus)是象山港黑鯛最重要的餌料生物種類,其在黑鯛胃含物中不僅出現的頻率較高,而且相對豐度較大,6個種類合計占據的黑鯛餌料生物相對豐度比重高達60.90%。此外,還有部分餌料生物雖相對豐度較高但出現頻率較低,如小刀蟶(Cultellusattenuatus)、平角渦蟲(Planoceramultitentaculata)、粗尾溝藻(Torodiniumrobustum)、尖尾全溝藻(Teleaulaxacuta)和海洋線蟲(Chromadorinasp.)等僅出現于單個樣品中。

從餌料生物組成類型上看,象山港海域黑鯛食性較為復雜,攝食對象包含大型藻類(石莼等)、貝類(熊本牡蠣和毛蚶等)、浮游動物(胸刺水蚤等)、浮游植物(尖尾全溝藻等)、底棲動物(沙蠶Dendronereissp.等)、魚類(褐菖鲉等)和蟹類(日本蟳等)等多個海洋生物類群,黑鯛展現了較為典型的雜食性特征。

表3 黑鯛主要餌料物種的出現頻率和相對豐度百分比

2.3 不同齡組黑鯛食性特征

在1至4齡組黑鯛樣品中檢出并鑒定餌料生物種類數分別21、23、23和17種。其中,石莼、熊本牡蠣、胸刺水蚤、日本蟳、毛蚶和褐菖鲉等重要餌料生物種類在4個齡組黑鯛樣本中均有分布,上述種類在各齡組黑鯛餌料生物相對豐度中的占比為44.3%—77.8%。各齡組黑鯛優勢餌料生物種類組成略有差異,如1齡黑鯛個體優勢餌料生物為胸刺水蚤(31.52%,相對豐度百分比,下同)、石莼(22.13%)和日本蟳(13.72%)；2齡黑鯛個體優勢餌料生物為日本蟳(21.16%)、銼蛤(19.65%)和石莼(16.04%)；3齡黑鯛個體優勢餌料生物為褐菖鮋(18.42%)、毛蚶(18.30%)和石莼(10.80%)；4齡黑鯛個體優勢餌料生物為熊本牡蠣(58.21%)、石莼(8.35%)和褐菖鮋(3.44%)。

聚類分析結果如圖2所示,象山港黑鯛個體的餌料生物組成并未呈現明顯的齡組差異格局(橫坐標表示個體的年齡)。相似性分析檢驗(ANOSIM)結果也顯示：不同年齡組黑鯛的餌料生物組成差異尚未達到顯著性水平(R=0.014,P=0.446)。

圖2 不同齡組黑鯛個體餌料生物組成的聚類分析圖Fig.2 Cluster of prey composition in black sea bream of different ages

3 討論

魚類營養供應是決定其生長發育的關鍵因素,也是影響漁業資源可持續產出的重要因子。食性分析方法的準確性和精確性直接關系到食性相關理論的探索,同時也關乎研究結果在魚類保護實踐過程中的應用。黑鯛是我國近海重要的增殖養護對象,其增殖養護措施的精細化設置需要食性特征等基礎生態學理論的支撐。目前,國內關于黑鯛在自然海域攝食習性的研究僅見于柏懷萍[20]等利用胃含物分析法的相關研究報道,胃含物分析法雖具簡便易操作的特點,可對個體較大且消化程度較低的胃含物直接根據形態特征加以判別,但對消化較為充分的胃含物則僅能通過耳石、眼珠、殘肢等一些難以消化的殘留物進行鑒定,精確性存在較大欠缺[21- 24]。近年來,食性分析方法也在不斷改進和更新[25-29],高通量測序法因其高效性受到研究人員的青睞。本研究利用高通量測序法在魚類食性分析過程所具備的高靈敏度的技術特點,對象山港黑鯛的餌料生物組成進行探索研究,研究結果可為準確、系統掌握黑鯛攝食習性提供有益補充。

與傳統的胃含物分析結果相比[23-24],高通量測序法所檢測到的黑鯛主要餌料生物種類組成相似,但高通量測序法具有明顯的樣品需求少、工作量小和檢出物種多的特點。此外,借助于高通量測序法的靈敏性高的特點,本研究從消化程度較高的空胃黑鯛胃部粘液樣品中檢測鑒定得到石莼、滸苔、日本蟳、熊本牡蠣、胸刺水蚤、毛蚶以及多種藻類餌料生物種類,并鑒定出部分傳統胃含物分析法未能檢測到的微藻和小球藻等相對豐度較低的黑鯛餌料生物種類,高通量測序法在黑鯛等雜食性魚類攝食生態研究中顯現出較為明顯的技術優勢[23]。此外,發現18S rDNA的保守性以及目前按照97%的序列相似度進行歸并的分析標準也會影響到高通量測序對某些物種鑒別的精準度,對此可考慮將克隆測序法與之相結合以達到更優的鑒定結果；而本次研究過程中基于已有的象山港海區資源調查名錄,將序列比對所得的注釋物種加以人工校對也顯著地提高了所鑒定物種的準確性。相信隨著測序技術以及數據分析技術的快速發展,高通量測序技術在魚類食性研究中將具有更廣闊的應用前景。

結果顯示,黑鯛攝食種類范圍較廣,僅本次分析就在黑鯛胃含物中鑒定出9個門類中的62種餌料生物,這些餌料生物分屬于大型藻類、貝類、浮游動物、浮游植物、底棲動物、魚類和蟹類等多個海洋生物類群,黑鯛展現了較為典型的雜食性特征。石莼、熊本牡蠣、胸刺水蚤、日本蟳、毛蚶和褐菖鲉是象山港黑鯛優勢餌料生物種類,其中石莼、熊本牡蠣和褐菖鲉均為典型的巖相生境分布物種,其對應的分布水域與黑鯛(礁棲魚類)基本一致,是象山港黑鯛的主要餌料供給對象[30]。

早期黑鯛調查發現,黑鯛幼魚和成魚食性存在差異,其中幼魚以環節動物和蝦類為主要食物類群,而成魚以藻類、環節動物、甲殼類和貝類為主[20]。結果表明,1齡黑鯛個體優勢餌料生物為胸刺水蚤、石莼和日本蟳；2齡黑鯛個體優勢餌料生物為日本蟳、銼蛤和石莼；3齡黑鯛個體優勢餌料生物為褐菖鮋、毛蚶和石莼；4齡黑鯛個體優勢餌料生物為熊本牡蠣、石莼和褐菖鮋。由此可見,其主要餌料物種組成與之前調查結果相似。由于本次研究所捕捉黑鯛個體均為1年齡以上的成魚,故未能對幼魚食性進行分析比較。而對本次不同年齡組之間的比較發現1至4齡黑鯛個體的攝食食性有所差別,其中1齡和2齡個體中優勢餌料生物相似性較高,而3齡和4齡個體中的優勢餌料生物相似性較高。同時,我們結合黑鯛年齡和體長特征,利用相似性分析檢驗(ANOSIM)檢驗了不同年齡組黑鯛成魚個體的餌料物種分布特征,但結果顯示不同年齡組黑鯛餌料物種組成并無顯著性差異。考慮到本次研究分析所用的黑鯛個體數量有限,這可能會影響到黑鯛不同齡組間的餌料物種差異分析；同時,由于魚類攝食受自身生長和環境餌料生物組成等諸多因素的影響,黑鯛樣品所處的具體生活環境也可對餌料物種組成造成影響,如本次檢出物種中蝦類和螺類樣品較少,且部分其他食物種類也與傳統方法鑒定結果存在一定的差異。鑒于上述情況,建議在后續研究中適當擴充黑鯛樣品采集范圍(包括取樣季節、樣品規格、采集區域和樣品數量等),并結合樣品采集水樣的生物和環境信息,系統分析黑鯛攝食對象、攝食策略等營養生態特征,以期為科學制定黑鯛增殖養護措施、保持黑鯛物種種群穩定性提供科學依據。