赤水河流域不同地區醬香型白酒風味化合物分析

唐 平，盧 君,*，畢榮宇，山其木格，王 麗，王 凡，李長文

（1.貴州國臺酒業股份有限公司，貴州 仁懷 564501；2.天士力控股集團有限公司研究院，天津 300410）

醬香型白酒，作為中國十二大香型白酒之一，因其獨特的風味、口感和相對較好的飲后舒適度，深受廣大消費者的青睞[1]。醬香型白酒的風味特征在一定程度上是由其獨特地理位置（如水、土壤、氣候和微生物多樣性）以及特殊釀造工藝和特殊原料決定的，因而也就有“離開了茅臺鎮就生產不出正宗醬香型茅臺酒”的說法[2]。而實際上目前醬香型白酒在全國都有生產，尤其是赤水河流域分布著眾多著名的醬香白酒企業，例如茅臺、郎酒、習酒、國臺等企業。然而，由于產地的地理環境、氣候以及微生物等原因，不同地區生產的醬香型白酒的品質有一定差異，在風味化學上表現為酒中微量香氣成分及其相互間的量比關系不同[3-4]。目前，對朗姆酒[5-6]、葡萄酒[7-9]、黃酒[10-11]、濃香型白酒[12-13]在地區風味差異已有研究，但是對不同地區醬香型白酒的風味特征還鮮見報道，研究不同地區的醬香型白酒特征性香氣成分，對于探明不同地區的醬香型白酒產品的品質內涵具有重要意義。

本研究采用頂空固相微萃取/液液萃取-氣相色譜-質譜（headspace solid phase microextraction/liquid-liquid extraction-gas chromatography-mass spectrometry，HSSPME/LLE-GC-MS）聯用技術，以赤水河流域的醬香型白酒為研究對象，圍繞茅臺鎮核心地區、習水地區、遵義地區、金沙地區以及四川地區選取不同品牌的56 個代表性的醬香型白酒，以揮發性香氣成分為基礎，建立不同地區醬香型白酒分類模型，進而分析不同地區醬香型白酒的香氣特征及地區差異規律。以期為我國醬香型白酒產品的地區判別和溯源研究提供借鑒，促進醬香型名優白酒質量安全與原產地溯源制度的建立，為醬香型白酒的風味品質提升提供一定的理論支撐[14-15]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗酒樣材料均通過市售或酒廠之間標準酒樣交換的方式獲得，其中茅臺鎮核心地區（MTCQ）26 個樣品（MT-1～6、DYT-1～7、GT-1～13），習水地區（XJCQ）8 個樣品（XJ-1～8），遵義地區（ZJCQ）7 個樣品（ZJ-1～7），金沙地區（JSCQ）7 個樣品（JS-1～7），古藺地區（LJCQ）8 個樣品（LJ-1～8），總計56 個醬香型白酒樣品。

無水乙醇（色譜純） 天津市康科德科技有限公司；乙醛、甲酸乙酯、乙酸乙酯、甲醇、2-丁醇、丁酸乙酯、正丙醇、異丁醇、戊酸乙酯、乙酸異戊酯、正丁醇、異戊醇、己酸乙酯、庚酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸、糠醛、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、苯乙醇、庚酸、辛酸等57 種標準物質（均為色譜純，純度≥98.0%）天津市光復精細化工研究所；氯化鈉（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

AB204-S精密電子天平 梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司；Milli-Q超純水儀 美國Millipore公司；2 mL進樣瓶、10 μL/50 μL微量進樣器 美國Agilent公司；Trace 1300氣相色譜儀、Trace 1300-ISQ氣相色譜-質譜聯用儀 美國賽默飛世爾科技公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭、固相微萃取裝置、手動進樣手柄 美國Supelco公司；IT-09A型恒溫磁力攪拌器 上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 白酒樣品基本理化指標的分析

總酸、總酯含量的測定采用中和滴定法[16]。

1.3.2 白酒樣品香氣成分分析

1.3.2.1 GC法分析白酒樣品香氣成分

取5 mL酒樣置于儲備瓶中，加入50 μL內標配制液（叔戊醇、乙酸正戊酯、2-乙基丁酸）混合樣，混合均勻后，分裝至進樣瓶。

GC條件：HP-FFAP色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進樣口溫度200 ℃；分流比25∶1；載氣為高純氮氣；流速1.5 mL/min；升溫程序：起始溫度37 ℃，保持7 min，以3.5 ℃/min升溫至45 ℃，保持3 min，再以5 ℃/min升溫至80 ℃，10 ℃/min升溫至100 ℃，保持4 min，再以20 ℃/min升溫至180 ℃，15 ℃/min升溫至200 ℃，保持7 min；氫火焰離子化檢測器溫度250 ℃。

1.3.2.2 HS-SPME-GC-MS法分析白酒樣品香氣成分

HS-SPME條件：準確量取2.5 mL酒樣，7.5 mL超純水置于20 mL頂空進樣瓶中，并加入50 μL 2-乙基丁酸內標溶液，2 g氯化鈉，將頂空進樣瓶密封，在50 ℃、300 r/min平衡10 min；將老化好的萃取頭插入頂空瓶中，恒溫萃取40 min后取出纖維頭，插入GC進樣口，解吸5 min。

GC條件：HP-FFAP色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進樣口溫度200 ℃；分流比50∶1；載氣為氦氣；升溫程序：起始溫度37 ℃，保持9 min，以3 ℃/min升溫至45 ℃，再以10 ℃/min升溫至100 ℃，保持4 min；再以15 ℃/min升溫至180 ℃，保持5 min，再以5 ℃/min升溫至200 ℃，保持4.5 min，總運行時間40 min。

MS條件：電子電離源（electron ionization，EI）；電子能量70 eV；離子源溫度250 ℃；傳輸線溫度250 ℃；掃描模式為全掃描；質量掃描范圍m/z30～550。

1.3.2.3 LLE-GCMS法分析白酒樣品香氣成分

準確吸取5 mL酒樣，加入15 mL超純水，2.0 g氯化鈉，50 μL 2-乙基丁酸內標，2 mL乙醚，渦旋振蕩3 min，靜置30 min，吸取上層有機相1 mL至進樣瓶。

GC條件：HP-FFAP色譜柱（50 m×0.25 mm，0.20 μm）；進樣口溫度250 ℃；不分流，載氣為高純氦氣，流速1.5 mL/min；升溫程序：起始溫度40 ℃，保持2 min，以3.5 ℃/min升溫至90 ℃，再以5 ℃/min升溫至230 ℃，保持10 min，總運行時間54 min。

MS條件：EI；電子能量70 eV；離子源溫度250 ℃；傳輸線溫度250 ℃；掃描模式為全掃描；質量掃描范圍m/z30～550。

1.3.3 白酒樣品香氣成分的定性及定量分析

1.3.3.1 定性分析

通過NIST譜庫檢索并結合標準品標準圖譜比對確定。

1.3.3.2 定量分析

骨架物質：采用GC分析，以叔戊醇、乙酸正戊酯、2-乙基丁酸為內標物質，以待測物與相應內標物的質量濃度比為橫坐標，峰面積之比為縱坐標，建立標準曲線，定量分析甲酸乙酯、乙酸乙酯、甲醇、2-丁醇、丁酸乙酯、正丙醇、異丁醇、戊酸乙酯、乙酸異戊酯、正丁醇、異戊醇、己酸乙酯、庚酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸、糠醛、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、苯乙醇、庚酸、辛酸。

痕量物質：采用LLE-GC-MS分析，以2-乙基丁酸為內標物質，利用選擇離子掃描法測定化合物的峰面積，以待測物與相應內標物的質量濃度比為橫坐標，峰面積之比為縱坐標，建立標準曲線，定量分析苯甲醛、苯乙醛、異丁醛、5-甲基呋喃醛、2-戊酮、2-庚酮、2-壬酮、異丁酸、異戊酸、4-甲基戊酸、2-戊醇、庚醇、正辛醇、苯乙醇、正戊醇、正己醇、辛醇、1-壬醇、3-甲基丁酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸戊酯、戊酸丁酯、乙烯二乙酯、己酸戊酯、壬酸乙酯、3-苯丙酸乙酯、十四酸乙酯、己酸丙酯、丙酸糠酯、丁二酸二乙酯、苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、愈創木酚甲醚。

1.4 數據處理

所有風味化合物數據采用標準化處理，利用SIMCA-P 14軟件建立偏最小二乘-判別分析（partial least squares-discriiminate analysis，PLS-DA）模型，對風味數據進行可視化趨勢分析，并篩選重要風味化合物；利用R語言繪制層次聚類-熱圖以及相關性關聯網絡，表征風味化合物的潛在聯系。

2 結果與分析

2.1 基本理化指標測定

白酒中的酸、酯是重要的呈香呈味物質，對白酒的品質有著十分重要的影響。據GB/T 26760—2011《醬香型白酒》[17]的要求，優質醬香型白酒的總酸含量需大于1.40 g/L，總酯質量濃度需大于2.20 g/L。研究中，對不同地區醬香型白酒樣品的總酸總酯進行了檢測。由表1可知，不同地區的醬香型白酒樣品的總酸質量濃度均大于2.0 g/L，總酯質量濃度也均大于3.0 g/L，均遠超優級標準，是品質較好的醬香型白酒。同時，顯著性分析結果發現不同地區的醬香型白酒樣品總酯含量無顯著性差異（P＞0.05），總酸含量有顯著性差異，茅臺鎮核心地區的總酸含量最高，古藺地區次之，且與金沙地區存在顯著性差異（P＜0.05）。

表 1 不同地區醬香型白酒樣品總酸、總酯含量Table 1 Contents of total acids and total esters of Maotai-flavor liquor from different geographical origins g/L

2.2 不同地區醬香型白酒的香氣成分特征分析

圖 1 不同地區醬香型白酒代表性香氣成分GC-MS分析總離子流色譜圖Fig. 1 Total ion current chromatograms of representative aroma compounds of Maotai-flavor Baijiu samples from different producing areas

表 2 不同地區醬香型白酒中的香氣成分Table 2 Relative contents of aroma compounds in Maotai-lavor Baijiu samples collected from different producing areas

續表2

續表2

通過HS-SPME與GC-MS聯用對5 個地區醬香型白酒的香氣成分進行檢測和分析，如圖1、表2所示。白酒的風味獨特性與其成分密切相關，在白酒中含有數量眾多組成不同的酸類、酯類和醇類等香味物質，這些物質具有不同的香氣和口味，彼此相互影響，共同構成白酒風味的多樣性[18-19]。研究中選取5 個地區的56 種醬香型白酒樣品，利用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭結合GC-MS共檢測出85 種風味物質，其中酯類化合物45 種，醇類化合物11 種，酮類化合物7 種，醛類化合物8 種，酸類化合物3 種，烷烴類化合物3 種，其他類化合物8 種。

MTCQ共檢測出61 種風味物質，其中醛類化合物6 種，酯類化合物32 種，醇類化合物11 種，酮類化合物3 種，其他化合物9 種，其中酯類化合物相對含量最高，達到69.06%，其次相對含量較高的分別為醇類化合物（10.94%）、醛類化合物（3.45%）、酮類化合物（0.64%）。XJCQ共檢測出63 種風味物質，其中醛類化合物5 種，酯類化合物36 種，醇類化合物11 種，酮類化合物5 種，其他化合物6 種，其中酯類化合物相對含量最高，達到77.30%，其次相對含量較高的分別為醇類化合物（8.72%）、醛類化合物（5.94%）、酮類化合物（1.07%）。ZJCQ共檢測出64 種風味物質，其中醛類化合物6 種，酯類化合物36 種，醇類化合物10 種，酮類化合物6 種，其他化合物6 種，其中酯類化合物相對含量最高，達到33.49%，其次相對含量較高的分別為醇類化合物（6.65%）、醛類化合物（2.74%）、酮類化合物（1.24%）。JSCQ共檢測出70 種風味物質，其中醛類化合物7 種，酯類化合物37 種，醇類化合物11 種，酮類化合物9 種，其他化合物6 種，其中酯類化合物相對含量最高，達到77.45%，其次相對含量較高的分別為醇類化合物（8.7%）、醛類化合物（6.03%）、酮類化合物（1.34%）。LJCQ共檢測出63 種風味物質，其中醛類化合物5 種，酯類化合物33 種，醇類化合物10 種，酮類化合物8 種，其他化合物7 種，其中酯類化合物相對含量最高，達到77.89%，其次相對含量較高的分別為醇類化合物（8.85%）、醛類化合物（4.63%）、酮類化合物（1.31%）。

通過分析可知，不同地區的醬香型白酒的主要香氣種類基本相似，體現了醬香型白酒的主要香氣特性，但同一種類香氣化合物及其相對含量在不同地區的差異較大。不同地區的醬香型白酒的主要風味物質為酯類化合物，其中茅臺核心地區的酯類化合物種類最多。酯類化合物是白酒中重要的風味化合物，是白酒中水果、花香和甜味的主要來源，如蘋果、香蕉、菠蘿、玫瑰和蜂蜜，在不同香型白酒中占35%～70%[20]。其次相對含量較高的為醇類化合物，醬香型白酒中醇類化合物相對含量高，其高級醇比濃香型白酒高1 倍以上[21-22]，醇類是白酒的醇甜和助香劑的重要來源，也是酯類的前驅物質，它們可以增加酒體的甜度和醇厚感，香氣特征主要是水果香和花香[23]。

2.3 不同地區醬香型白酒香氣成分差異性分析

2.3.1 PLS-DA結果

圖 2 不同地區醬香型白酒PLS-DA散點圖Fig. 2 PLS-DA score plots discriminating Maotai-flavor liquor samples from different geographical origins

不同地區的醬香型白酒的香氣成分呈現顯著差異，為考察不同地區醬香型白酒樣品香氣成分的差異，研究中選取56 個醬香型白酒中的25 種基本骨架香氣物質以及結合GC-O篩選的OAV大于1的32 種重要香氣物質進行準確定量分析。利用SIMCA-P 14軟件基于香氣定量結果建立不同地區醬香型白酒PLS-DA分類模型，對風味化合物進行可視化趨勢分析，如圖2所示。通過PLS-DA模型將醬香型白酒樣品明顯區分為3 類。模型分類良好，且模型的解釋變量和預測能力分別為0.930和0.842。遵義地區、習水地區與茅臺鎮核心地區的樣品相互聚攏程度比較大，為一類，主要分布在第1、2象限，說明樣品間差異相對較小。盡管3 個地區的酒樣沒有被很好地區分開，但它們也表現出各自的分布趨勢。這3 個地區的醬香白酒的風味化合物分布特征相似度較大的原因可能是酒廠的地理位置上更為接近，環境條件和微生物菌群組成差異較小，均采用傳統醬香白酒釀造工藝等[24]。金沙地區的醬香型白酒主要集中在第3象限，古藺地區的醬香型白酒主要集中在第2象限，明顯區分于其他地區酒樣，說明樣品間差異稍大，原因可能是白酒釀造屬于開發式的自然發酵過程，其釀造環境的微生物區系差異所致。同時，也正是這種復雜的微生物種類，才能形成白酒中成分眾多風味化合物，造就白酒不同的風格[25-27]。

PLS-DA是基于PLS法回歸的一種判別方式，以預設分組變量，作為有監督的分析，彌補主成分分析方法的不足，強化組間的差異，PLS-DA變量重要性因子（variable importance in projection，VIP）可以量化PLSDA的每個變量對分類的貢獻度[28]，便于篩選重要的特征物質[29]。如圖3所示，VIP值越大，變量在不同產地間差異越顯著[30]。

圖 3 不同地區醬香型白酒PLS-DA VIP值Fig. 3 PLS-DA VIP values for differential flavor compounds in Maotai-flavor liquors from different geographical origins

為了篩選地區差異重要影響的風味物質，以VIP值大于1為指標，確定對地區區分有重要貢獻的風味物質20 種，包含2-戊醇、2-丁醇、己酸、己酸乙酯、乳酸乙酯、己酸異戊酯、正丙醇、辛酸乙酯、1-戊醇、辛酸、乙酸、2-甲基丙醛、庚酸乙酯、庚酸、甲醇、苯乙醇、異戊醇、2-糠醇、戊酸丁酯、戊酸乙酯。其中2-戊醇（VIP=1.781 92）、2-丁醇（VIP=1.714 18）、己酸（VIP=1.679 92）、己酸乙酯（VIP=1.630 43），為重要的關鍵影響因子。2-戊醇、2-丁醇均有水果香和花香，對白酒的整體香氣起到增益作用，2-丁醇的刺激性氣味具有調和整體香氣的能力[31]。己酸雖然具有較強的刺激性氣味，但是也可以調節白酒的整體風味，具有重要的助香作用。己酸乙酯具有強烈的果香和酒香香氣，對醬香型白酒的感官特征具有重要的貢獻，同樣是古藺地區中含量最高的酯類物質，其含量明顯高于其他地區醬香型白酒。這與Zhu Jiancai等[32]研究結果一致，其研究表明己酸乙酯是3 款郎酒產品中香氣強度最高的物質，平均含量為1 692.01～2 062.5 μg/kg。推測原因可能是古藺地區酒廠（例如郎酒廠）既生產醬香白酒，也在生產濃香白酒，因此可能在釀造環境中存在一定量的代謝產己酸乙酯的微生物，加之開放式自然發酵的工藝特點，進而導致了醬香型白酒的酒體中也含有較高含量的己酸乙酯。同時，己酸、己酸乙酯、乳酸乙酯（VIP=1.448 56）等物質是“窖底香型”調味酒的主要香氣成分[33]，它是由品質好的窖池經過較長時間的發酵，取窖底酒醅蒸餾，貯存而得，所以推測其物質含量的差異也可能是由于不同醬香型白酒生產企業對窖底糟醅、窖底泥質量管理能力有差異導致。另外，地域周邊環境因素和微生物菌群組成的差異也是導致不同區域醬香型白酒風味物質差異的重要原因，蔡雪梅等[33]已證實不同地域的窖泥微生物群落存在差異，而區域越相近的窖底泥的微生物群落結構越相似。本實驗中區分5 個地區的醬香型白酒物質組成的關鍵因子包含了“窖底香型”調味酒的主要香氣成分，因此，能夠推測出“窖底香型”調味酒對于醬香型白酒的風味質量形成起到了至關重要的作用，未來醬香型白酒企業可以從提升“窖底香型”調味酒質量方面重點研究，進而提升產品質量和形成差異風格等。

圖 4 不同地區醬香型白酒聚類及定量重要化合物熱圖Fig. 4 Heat map from hierarchical clustering analysis of Maotai-flavor liquors from different geographical origins

2.3.2 層次聚類分析

為了進一步探索不同地區醬香型白酒關鍵香氣化合物的差異，采用層次聚類分析并結合熱圖分析，直觀展示了56 種重要風味化合物在不同地區間的分布規律（3-辛醇含量較低，圖中未顯示）。如圖4所示，顏色（由深到淺）表示相對含量由低到高的變化，顏色越深表示相對含量越多，顏色越淺相對含量越少。

酯類物質是白酒風味的重要貢獻物質，其中乙酸乙酯以及己酸乙酯是相對含量較高的酯類物質，茅臺核心地區的乙酸乙酯相對含量明顯高于其他幾個地區，而己酸乙酯相反，茅臺核心地區的相對含量最低，古藺地區以及金沙地區的相對含量相對較高。另外，值得注意的是，古藺地區的酒樣中的乳酸乙酯相對含量同樣偏高于其他地區，金沙產區的相對含量較低。脂肪酸是白酒中重要的呈香物質，碳原子數小于4的脂肪酸如乙酸、丙酸、丁酸在茅臺核心地區的平均相對含量明顯高于古藺地區，茅臺核心地區的平均相對含量是古藺地區的1.32 倍，而碳原子數大于5的脂肪酸如戊酸、己酸、庚酸、辛酸在古藺產區的平均相對含量明顯高于其他地區。白酒中這些短鏈脂肪酸主要是窖泥中梭菌的代謝產物，它們能加快乙醇在體內的代謝，降低白酒的醉度，影響腸道內微生物的生長代謝，保護腸黏膜屏障，參與宿主免疫與炎性反應，與酒精性肝臟疾病進程有密切聯系，具有一定的生物活性[34]。白酒中長鏈脂肪酸主要是由丁酸菌和己酸菌將乙酸等代謝轉化為丁酸或己酸，推測原因可能是古藺地區與茅臺鎮核心產區地理環境差異較大，而導致微生物差異較大。醇類化合物主要由糖和氨基酸在釀酒酵母的作用下降解產生，醬香型白酒采用高溫大曲，其蛋白質含量高，且其發酵溫度也高于其他香型白酒，這些因素都會促進酒中高級醇的生成。5 個地域的醇類物質相對含量水平總體相差不大，但單體醇類物質的含量上存在一定的差異，如金沙地區的正丙醇相對含量明顯高于其他地區，不同地區的2-戊醇相對含量同樣也存在差異，茅臺核心地區的相對含量最低，古藺地區以及金沙地區相對含量偏高。

不同地區醬香型白酒關鍵香氣化合物的差異造成不同地區的醬香型白酒的風格品質差異，層次聚類分析結果與PLS-DA結果一致，56 個酒樣可以明顯分為不同的類別，進一步驗證了不同地區醬香型白酒香氣存在顯著差異。不同地區的56 種醬香型白酒分為3 類，DYT與GT地處茅臺鎮核心地區，分為一類，ZJ樣品也集中于此類別中，MT與XJ分為一類。而古藺地區與金沙地區的酒樣為明顯區分于其他地區的兩類酒樣。

3 結 論

本研究以揮發性香氣成分為基礎，以赤水河流域的醬香型白酒為研究對象，圍繞茅臺鎮核心地區、習水地區、遵義地區、金沙地區以及古藺地區選取56 個不同品牌的醬香型白酒，共檢測出85 種香氣成分，其中酯類化合物45 種，醇類化合物11 種，酮類化合物7 種，醛類化合物8 種，酸類化合物3 種，烷烴類化合物3 種，其他類化合物8 種，不同地區的醬香型白酒的主要香氣種類基本相似，含量差異較大。以57 種重要香氣化合物作為關鍵分類因子，建立不同地區醬香型白酒分類模型，不同地區的醬香型白酒樣品呈現明顯的分離趨勢，以VIP及層次聚類分析結合熱圖分析，表征其在不同地區醬香型白酒中香氣成分的分布規律。本研究可為不同地區的醬香型白酒的香氣差異提供一定的理論支持。