3 種產量水平下釀酒甜葡萄果實品質的差異

樂小鳳，曹建宏，趙亞蒙，尹春曉，鞠延侖，張振文,3,*

（1.西北農林科技大學葡萄酒學院，陜西 楊凌 712100；2.香格里拉酒業股份有限公司，云南 迪慶 674400；3.陜西省葡萄與葡萄酒工程中心，陜西 楊凌 712100）

刺葡萄（Vitis davidiiFoex.）是葡萄科葡萄屬東亞種群的一種野生種質資源，原產于湖南、云南、廣東、江西、浙江等省，是多年生落葉藤本植物[1]。刺葡萄作為湖南特色的種質資源之一，具有優良的品種特性，湖南省懷化市中方縣的刺葡萄也開始從鮮食往釀酒的方向發展[2]。

葡萄果實中的酚類物質對葡萄酒顏色、口感、酒體和結構起著重要的作用，酚類物質的生物合成與積累主要受葡萄品種、土壤條件、氣候、產地、栽培方式[3-9]等因素的影響。產量的調控是影響釀酒葡萄果實與葡萄酒質量的一項重要的栽培措施[10-13]，可通過疏花、疏果和冬剪等措施實現。葡萄新梢上結果過多，葡萄果實糖分和酚類物質積累緩慢，養分的消耗過度易造成葡萄樹體的早衰，從而導致葡萄果粒不能正常生長和著色困難；葡萄新梢上結果過少，影響葡萄植株生殖生長與營養生長的平衡。每個葡萄品種的適宜產量不一，豆一玲等[14]對歐亞種釀酒葡萄霞多麗進行不同負載量的實驗，結果顯示，在一定范圍內降低葡萄負載量能提高漿果和葡萄酒品質，產量過大則品質表現較差；宋潤剛等[15]研究結果表明隨著山葡萄產量的增加，果穗質量、果粒質量和果實總糖含量大幅度降低；陳奕霖等[16]以山東煙臺地區歐亞種釀酒葡萄蛇龍珠為實驗材料，研究不同產量水平對漿果品質的影響，結果顯示，隨著產量的降低，果實的成熟期呈明顯縮短的趨勢，葡萄果皮的總酚和總花色素含量呈上升趨勢，且在一定的產量范圍內，產量降低，單寧含量上升。目前，有關產量對釀酒葡萄果實品質影響的報道較多[17-19]，對刺葡萄品系品質的研究較少，探討刺葡萄的主要酚類物質對刺葡萄酒釀造有著重要的作用。本實驗以刺葡萄品系中的甜葡萄品種為試材，研究不同產量對甜葡萄果實品質及酚類物質的影響，以期為湖南省刺葡萄酒的生產釀造提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗地位于湖南省懷化市中方縣桐木鎮，供試材料為刺葡萄品系中的甜葡萄品種，定植于2008年，棚架，株行距為3.5 m×5.5 m，常規管理。

甲酸、甲醇、鹽酸和乙腈均為分析級，所有花色苷單體標準樣和單體酚單體標準樣均為色譜純，購自美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀、UV-1700紫外-可見分光光度計美國Agilent公司；5804R低溫冷凍離心機 德國Eppendorf公司；KH200KDB超聲波振蕩器 昆山禾創超聲儀器有限公司；CentriVap 78100-40離心濃縮系統美國Labconco公司；FA2004型電子天平 上海精科實業有限公司。

1.3 方法

1.3.1 產量管理和采樣

2014年和2015年，當甜葡萄果粒發育到黃豆粒大小時，即花后兩周時進行疏穗處理，高產為原有最高產量，每個結果枝果穗處理成平均2 穗，產量預測2 500 kg/667 m2（L3）；中產將每個結果枝果穗處理成平均1.5 穗，產量預測1 900 kg/667 m2（L2）；低產處理為將所有果枝均留1 穗，產量預測1 300 kg/667 m2（L1）。每個處理隨機選長勢一致的20 株葡萄植株，均重復3 次。葡萄成熟時（還原糖質量濃度＞170 g/L），每個處理隨機采600 粒果實，3 次生物學重復。隨機取200 粒果實用于測定還原糖和總酸含量，剩余葡萄樣品存儲于-40 ℃冰箱，用于花色苷和單體酚的測定。

1.3.2 果實基本指標的測定

采用斐林試劑熱滴定法測定還原糖含量[20]；酸堿滴定法測定總酸含量[21]。

1.3.3 果皮花色苷測定

每個處理隨機取200 粒果實，冷凍且避光狀態下剝皮，液氮速凍后打粉并置于冷凍干燥機中烘干，隨機稱取0.5 g干粉，用10 mL甲酸-甲醇溶液（2%）溶解，避光超聲10 min后25 ℃搖床振蕩提取30 min，4 ℃、8 000 r/min離心5 min，取上清液，以上提取步驟重復4 次，合并上清液于旋轉蒸發儀31 ℃蒸干，殘渣用流動相溶解并定容至10 mL，-80 ℃保存備用，樣品進樣前用0.45 μm有機濾膜過濾，使用高效液相色譜-三重四極桿-離子阱串聯質譜儀檢測，分析條件參照文獻[22]。

1.3.4 果皮非花色苷單體酚類物質測定

干粉制備過程與花色苷一致，非花色苷單體酚類物質則稱取1.0 g干粉、添加5 mL蒸餾水和45 mL乙酸乙酯，25 ℃、150 r/min搖床中避光提取30 min，收集上清液，再重復提取3 次，合并上清液后于旋轉蒸發儀（30 ℃）蒸干，殘渣用甲醇溶解并定容至2 mL，-40 ℃保存備用，樣品進樣前用0.45 μm有機濾膜過濾，使用高效液相色譜-三重四極桿-離子阱串聯質譜儀檢測，分析條件參照文獻[22]。

1.4 數據處理

采用SPSS軟件進行數據處理，進行Duncan檢驗，P＜0.05，差異顯著。用Excel軟件制作圖表。

2 結果與分析

2.1 產量對甜葡萄果實總酸和還原糖含量的影響

如圖1所示，2014年和2015年甜葡萄總酸含量隨產量增大而增加，L3產量葡萄的總酸顯著高于其他2 個處理，其中L1的葡萄總酸含量最低；甜葡萄的還原糖含量則隨產量增大而降低，2014年和2015年的甜葡萄L1的還原糖質量濃度分別為193.87 g/L和187.66 g/L，與L3相比，分別提升了6.00%、6.90%。

表 1 產量對甜葡萄單體花色苷和含量的影響Table 1 Effect of different crop yields on anthocyanin composition and content of Tianputao berries

圖 1 不同產量的甜葡萄總酸（A）和還原糖（B）含量Fig. 1 Total acid (A) and reducing sugar (B) contents of Tianputao berries with different loading treatments

2.2 產量對甜葡萄果實單體花色苷含量的影響

如表1所示，各樣品均檢測到9 種花色苷，包括4 種基本花色苷，1 種咖啡酰化花色苷，4 種香豆酰化花色苷。4 種基本花色苷包括花翠素-3,5-O-二葡萄糖苷、甲基花翠素-3,5-O-二葡萄糖苷、二甲花翠素-3,5-O-二葡萄糖苷和二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷。2014年，除花翠素-3,5-O-二葡萄糖苷之外，其他3 種基本花色苷含量均隨著負載量的增加而顯著降低；2015年，除二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷和甲基花翠素-3,5-O-二葡萄糖苷含量表現為隨負載量的增加而降低外，其他基本花色苷含量均為L2處理最高。2015年，甜葡萄果皮的咖啡酰化花色苷含量為L1處理最低，咖啡酰化花色苷約占單體花色苷總量的2.00%。在酰化花色苷中，二甲花翠素-3,5-香豆酰化二葡萄糖苷含量占比最大，表現為L1處理含量略低。由表1可知，年份對花色苷總量影響較大，2014年表現為L1含量最高，2015年則為L2含量較高；其中基本花色苷總量均表現為L3處理的葡萄含量最低。

2.3 產量對甜葡萄果實非花色苷單體酚類物質含量的影響

表 2 不同產量的甜葡萄非花色苷單體酚類含量Table 2 Effect of different crop yields on non-anthocyanin monomeric phenolic compounds contents of Tianputao berries

如表2所示，其中羥基苯甲酸和羥基肉桂酸類物質占非花色苷單體酚類物質總量的比例小，黃酮醇類物質占比高達99%。從兩年的非花色苷單體酚類物質總量和黃酮醇類物質含量看，L2處理的葡萄含量最高，其次是L1處理，L3產量的葡萄含量最低。2014年，L1、L2和L3處理的葡萄中分別檢測到13、11 種和12 種非花色苷單體酚類組分，山柰酚-3-O-葡萄糖苷和3-羥基肉桂酸只在L1處理的葡萄中檢測到，二氫山柰酚只在L3處理的葡萄中檢測到；除了原兒茶酸和香草酸在L1處理中含量最高，其他非花色苷單體酚類組分含量均表現為L2處理的葡萄顯著高于另外2 個處理，其中槲皮素-3-O-半乳糖苷、鼠李糖素-3-O-半乳糖苷和丁香亭-3-O-葡萄糖苷的含量在L1和L3之間差異不顯著。2015年，L1處理的葡萄中未檢測到3-羥基肉桂酸，除阿魏酸和二氫山柰酚外，其他非花色苷單體酚類含量均表現為L2＞L1＞L3，且差異顯著。2014年的非花色苷單體酚類組分含量略高于2015年，這可能是由于年份之間的差異造成的。

2.4 不同產量甜葡萄果實的主成分分析（principal component analysis，PCA）

圖 2 不同產量甜葡萄品質的第1、2主成分得分散點圖Fig. 2 Scatter plot of the first two principal components for quality attributes of Tianputao berries with different crop yields

運用SPSS軟件對兩年不同產量甜葡萄的還原糖、總酸、單體花色苷以及非花色苷單體酚類含量分別進行PCA，并分別以前兩主成分作散點圖。由圖2可以看出，兩年間3 種產量下的甜葡萄分布范圍較為一致，分布較分散說明3 種產量下的甜葡萄品質具有差異性。2014年，PC1貢獻率為59.126%，主要反映了還原糖、總酸和大部分單體花色苷以及非花色苷單體酚類的變異信息；PC2貢獻率為39.513%，反映了部分非花色苷單體酚類的變異信息。影響L1處理葡萄的成分主要分布在PC1的正方向和PC2的負方向，L1產量下果實的還原糖、甲基花翠素-3,5-O-二葡萄糖苷、二甲花翠素-3,5-O-二葡萄糖苷、二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷、花翠素-3,5-O-二葡萄糖苷、花翠素香豆酰化葡萄糖苷、山柰酚-3-O-葡萄糖苷、原兒茶酸、香草酸和3-羥基肉桂酸含量更高。影響L2處理葡萄的成分主要分布在PC1和PC2的正方向，L2產量下果實的花翠素-3,5-香豆酰化二葡萄糖苷、槲皮素-3-O-半乳糖苷、鼠李糖素-3-O-半乳糖苷、丁香亭-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸酐、槲皮素-葡萄糖苷和槲皮素-3-O-鼠李糖苷含量更高。影響L3處理葡萄的成分主要分布在PC1和PC2的負方向，L3產量下果實的總酸、花翠素咖啡酰化葡萄糖苷、二甲花翠素-3,5-香豆酰化二葡萄糖苷和二氫山柰酚含量較高。2015年，PC1貢獻率為67.857%，主要反映了部分單體花色苷以及非花色苷單體酚類的變異信息；PC2貢獻率為26.329%，反映了總酸、花翠素咖啡酰化葡萄糖苷、二甲花翠素-3,5-香豆酰化二葡萄糖苷、阿魏酸、3-羥基肉桂酸和二氫山柰酚的變異信息。3 種產量下的甜葡萄分布與2014年較為一致，L1產量下果實的還原糖、甲基花翠素-3,5-O-二葡萄糖苷、二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷和花翠素-3,5-香豆酰化二葡萄糖苷含量較高；L2產量下果實的花翠素香豆酰化葡萄糖苷、甲基花翠素-3,5-香豆酰化二葡萄糖苷、原兒茶酸、香草酸、鼠李糖素-3-O-半乳糖苷、鼠李糖素3-O-葡萄糖苷和丁香亭-3-O-葡萄糖苷的含量更高；L3產量下果實的總酸和二氫山柰酚含量較高。

3 討論與結論

本實驗通過不同產量對甜葡萄果實還原糖、總酸、單體花色苷和非花色苷單體酚類的影響進行研究，結果表明，相比于2 500 kg/667 m2的產量，1 300 kg/667 m2和1 900 kg/667 m2的產量顯著提高了果實的還原糖含量，并降低了總酸含量，這與前人研究結果一致[23]。較低產量促進了果實成熟過程中呼吸作用對酸的消耗，從而降低了葡萄總酸的含量[24]。較高的還原糖含量可以有效提高酒的乙醇體積分數，從而增加酒的醇厚感；葡萄總酸含量降低能適當的減弱高酸度給葡萄酒帶來的刺激感，使葡萄酒更加平衡[12]。花色苷類物質是葡萄果實和葡萄酒的主要呈色物質，在很大程度上決定著葡萄果實和葡萄酒的品質，由花色素作為糖苷配基或乙酰化的糖苷配基和糖結合生成，其修飾方式與甲基化和羥基化程度有關，甲基化則能加深葡萄酒的紅色色調，羥基化使葡萄酒往藍色色調轉變[25-26]。葡萄中的花色苷通常會在C6位與香豆酸、咖啡酸、乙酸發生酰化反應，從而有助于顏色的穩定性[12]。花色苷在葡萄中是由類黃酮代謝途徑合成，主要由苯丙氨酸裂解酶、肉桂酸羥化酶、查爾酮合成酶、查爾酮異構酶、黃烷酮-3-羥化酶、二氫黃酮醇還原酶、無色花色素雙加氧酶、甲基轉移酶和谷胱甘肽轉移酶等相互作用合成的[27]，也受到MYB等相關轉錄因子的控制[19]。在葡萄中，花色苷的生物合成和積累主要受遺傳因素影響[28]，同時也受激素[29]和果實成熟度[30]等內部影響，環境因素[31-32]（溫度和光照）和田間栽培措施[9,33]（調虧灌溉、干旱、摘葉、避雨）也決定著花色苷的生物合成與積累。本實驗中，3 種產量下的刺葡萄果皮均檢測到9 種花色苷，低產量顯著提高了花色苷總量，這與King等[34]研究結果一致。相關研究也表明合理降低產量可以提高紅色葡萄漿果的花色苷含量，改善葡萄品質，也可以顯著改善葡萄酒的感官品質、結構感和收斂性[35-38]。疏穗處理可能改善了植株的庫源關系以及漿果的微環境，從而有利于花色苷的合成和積累[39]。非花色苷單體酚類是葡萄中重要的生物活性物質，主要包括羥基肉桂酸、羥基苯甲酸、黃酮醇、黃烷醇和芪類等[40]。黃酮醇類對酒的澀感也有一定影響，是葡萄酒的重要保健成分[41]，本研究中黃酮醇類物質占非花色苷單體酚類比例高達99%以上，兩年結果表明，1 900 kg/667 m2產量下的葡萄非花色苷單體酚類總量和黃烷醇類物質含量最高，2 500 kg/667 m2產量下最低，說明適量的疏穗可以有效提升葡萄非花色苷單體酚類物質的含量，這與劉迪迪等[12]研究結果一致。Haselgrove等[42]認為黃烷醇和黃酮醇等次生代謝物的濃度在一定程度上依賴于植株的產量。1 300 kg/667 m2產量下不利于葡萄黃酮醇的合成與積累，這可能是因為疏果較多時導致葡萄植株營養生長過剩，消耗養分的同時還易造成葉幕郁閉，從而不利于相關代謝物的合成與積累[43-45]。

本實驗通過對湖南省中方縣3 種產量模式下甜葡萄果實品質和酚類物質組成的分析發現，與2 500 kg/667 m2產量相比，1 900 kg/667 m2甜葡萄中花色苷組分和非花色苷單體酚類物質含量顯著提高，適當的減少產量可以為釀造優質刺葡萄酒提供理論依據。