亞硒酸鈉促進(jìn)多形漢遜酵母DL-1合成谷胱甘肽的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

王 婷，劉嬋嬋，任 娟，荊蓉蓉，錢衛(wèi)東,*

（1.陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安 710021；2.西安醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，陜西 西安 710032）

谷胱甘肽（glutathione，GSH）又稱γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸，是一種由L-谷氨酸、L-半胱氨酸及L-甘氨酸組成的活性三肽。其結(jié)構(gòu)中還原態(tài)的巰基能結(jié)合重金屬離子和氧自由基，具有緩解重金屬中毒、抗氧化功能，可以促進(jìn)糖類、脂肪及蛋白質(zhì)代謝，并具有防止溶血、防止皮膚色素沉積、有效防止食品的酶促或非酶促的褐變、增強(qiáng)食品風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)等作用。目前，GSH的制備方法主要包括化學(xué)合成法、酶轉(zhuǎn)化法及發(fā)酵法[1]。其中，利用釀酒酵母[2]（Saccharomyces cerevisiae）、畢赤酵母[3]（Pichia pastoris）、產(chǎn)朊假絲酵母[4]（Candida utilis）為工程菌發(fā)酵生產(chǎn)GSH的方法，具有菌種易培養(yǎng)、產(chǎn)量高、純度好、品質(zhì)安全，生產(chǎn)工藝完善等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品和食品等行業(yè)中GSH原料的生產(chǎn)。

多形漢遜酵母（Hansenula polymorpha）是美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的食品級(jí)酵母，屬于甲醇型酵母，具有營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單、耐酸（pH值適應(yīng)范圍為2.5～8.0）、耐高溫（溫度適應(yīng)范圍為25～48 ℃）、繁殖快、發(fā)酵密度高、便于遺傳操作的優(yōu)點(diǎn)，是乙型肝炎病毒表面抗原、人干擾素、胰島素等生物工程產(chǎn)品開(kāi)發(fā)和拓展的主要細(xì)胞平臺(tái)之一[5]。Wang Dahui[6]和Xu Ruoyang[7]等通過(guò)紫外線-γ射線復(fù)合誘變、優(yōu)化培養(yǎng)基補(bǔ)料方式、構(gòu)建基因重組菌株、低pH值脅迫[4]促進(jìn)產(chǎn)朊假絲酵母中GSH合成積累。錢衛(wèi)東等[8]以30 μg/mL Na2SeO3誘導(dǎo)多形漢遜酵母使酵母胞內(nèi)GSH產(chǎn)量提高到215.21 mg/L，但對(duì)于Na2SeO3誘導(dǎo)下多形漢遜酵母生物合成和積累GSH的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步闡明。

近年來(lái)，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-Seq）技術(shù)因其分辨率高、數(shù)據(jù)重現(xiàn)性好等優(yōu)勢(shì)，逐漸成為研究基因表達(dá)水平、新基因的檢測(cè)挖掘及其功能注釋的重要手段[9]。因此，本研究以多形漢遜酵母DL-1為出發(fā)菌株，利用Na2SeO3誘導(dǎo)酵母高效合成GSH，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)比出發(fā)菌株與誘導(dǎo)菌株的轉(zhuǎn)錄本信息，篩選其表達(dá)差異基因（differential expression genes，DEGs），富集與GSH代謝及調(diào)控相關(guān)的基因通路，為進(jìn)一步開(kāi)展多形漢遜酵母定向分子改良，提高合成GSH效率提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與培養(yǎng)基

多形漢遜酵母DL-1（ATCC 26012），由陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院功能微生物研究室保存。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，pH 6.0；發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖40 g/L，(NH4)2SO410 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母粉5 g/L，KH2PO42.3 g/L，MgSO40.5 g/L，pH 6.0。培養(yǎng)基滅菌條件：將葡萄糖溶液和不含葡萄糖的培養(yǎng)基分別置于115 ℃，高壓滅菌20 min，滅菌后按比例混勻，并以無(wú)菌的1 mol/L HCl或NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值。

1.1.2 試劑

Na2SeO3天津市恒興化工；2-硝基苯甲酸（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）、GSH美國(guó)Sigma公司；TRIzol Reagent（15596-026） 美國(guó)Invtrogen公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

J6-MI型冷凍離心機(jī) 美國(guó)Beckeman公司；Perkin-Elmer 402紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海第三分析儀器廠；多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)BioTek公司。

1.3 方法

1.3.1 種子培養(yǎng)

將-80 ℃冰箱中保藏的菌種迅速解凍至室溫，取1 mL接種至100 mL的種子培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r/min搖床中培養(yǎng)24 h。

1.3.2 Na2SeO3對(duì)多形漢遜酵母生長(zhǎng)抑制的EC50

取1 mL新鮮酵母發(fā)酵液，4 ℃、6 000 r/min離心10 min，沉淀以蒸餾水洗滌2 次，重懸，以細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)酵母細(xì)胞個(gè)數(shù)；2 倍比稀釋?xiě)乙海?00 μL置于酶標(biāo)儀，在600 nm波長(zhǎng)檢測(cè)其OD值，分析OD值與細(xì)胞濃度的相關(guān)性。將酵母種子液接種到96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，0.5～1.0×104個(gè)/孔，加Na2SeO3溶液，使Na2SeO3終濃度分別為600、500、400、300、200、100、50 μmol/L，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h；然后測(cè)其OD600nm值，計(jì)算Na2SeO3對(duì)多形漢遜酵母生長(zhǎng)抑制的EC50。

1.3.3 Na2SeO3對(duì)多形漢遜酵母生長(zhǎng)的影響

以5%的接種量，將酵母種子液接種添加Na2SeO3的發(fā)酵培養(yǎng)基中，使Na2SeO3終濃度分別為0、30、60、120、240、480 μmol/L，200 r/min、37 ℃培養(yǎng)12 h；隨后，在30 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)60 h；每間隔6 h 取樣，每次取5 mL發(fā)酵液，4 ℃、6 000 r/min離心10 min，沉淀以蒸餾水洗滌2 次，85 ℃烘干至恒質(zhì)量，測(cè)量菌體質(zhì)量濃度，以干質(zhì)量計(jì)。

1.3.4 多形漢遜酵母中GSH的提取和測(cè)定

DTNB可與GSH的巰基反應(yīng)，生成黃色的3-羧基-4-硝基苯硫酚，且在412 nm波長(zhǎng)處有強(qiáng)烈吸收峰，因此可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定酵母發(fā)酵液中GSH質(zhì)量濃度。取5 mL新鮮的酵母發(fā)酵液，4 ℃、6 000 r/min離心10 min，上清液用于檢測(cè)胞外GSH含量；沉淀以5 mL 0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）洗滌2 次，置冰浴中超聲波破壁20 min（功率400 W，超聲15 s，間歇10 s）；將發(fā)酵液上清液與菌體超聲破碎后獲得的上清液，分別加入1.5 mL 0.06% NaOH和0.5 mL 0.03%甲醛，混勻，室溫下靜置2 min；再加入2.5 mL DTNB分析液（100 μmol/L DTNB，0.25 mol/L Tris-HCl，pH 8.0）混勻，25 ℃ 孵育5 min，在412 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)GSH標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算酵母胞外、胞內(nèi)GSH產(chǎn)量，按照以下公式分別計(jì)算GSH的總產(chǎn)量、胞內(nèi)GSH含量[10-11]：

1.3.5 多形漢遜酵母轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

1.3.5.1 酵母培養(yǎng)及其RNA提取

將種子液以5%的接種量分別轉(zhuǎn)接到正常和添加Na2SeO3的發(fā)酵培養(yǎng)液中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期；于4 ℃、6 000 r/min離心10 min，棄去上清液；加4 ℃預(yù)冷RNase free的磷酸鹽緩沖液洗滌2 次；利用TRIzol試劑盒提取其總RNA；通過(guò)NanoDrop定量RNA濃度和純度，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和Agilent 2100鑒定RNA完整性。

1.3.5.2 文庫(kù)構(gòu)建和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

文庫(kù)的制備參照Illumina TruSeq RNA文庫(kù)制備試劑盒V2操作說(shuō)明，包括以下步驟：首先取1 μg檢測(cè)合格的總RNA，用磁珠富集mRNA；然后以逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成單鏈cDNA，經(jīng)DNA聚合酶合成雙鏈cDNA并連接測(cè)序接頭，構(gòu)建特異性cDNA文庫(kù)；最后使用Agilent 2100對(duì)文庫(kù)進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，將檢驗(yàn)合格的不同文庫(kù)置于Illumina HiSeq 2000平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.3.6 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)處理及分析

1.3.6.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量評(píng)估

將測(cè)序獲得Raw Data經(jīng)過(guò)去除接頭和過(guò)濾得到Clean序列[12]；使用Trinity軟件[13-14]將短的Clean序列組裝為Unigene序列；并將Clean序列與Unigene序列進(jìn)行比對(duì)[15]，得到Mapped Data；通過(guò)插入片段長(zhǎng)度檢驗(yàn)、隨機(jī)性檢驗(yàn)等進(jìn)行原始序列質(zhì)量評(píng)估[16]。

1.3.6.2 差異表達(dá)基因分析

將測(cè)序得到的Clean reads與Unigene庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)合RSEM[15-16]進(jìn)行基因表達(dá)量水平估計(jì)；應(yīng)用HTSeq方法對(duì)基因表達(dá)量進(jìn)行FPKM定量[17-18]；利用DESeq[19]進(jìn)行Na2SeO3誘導(dǎo)組和對(duì)照組間的基因表達(dá)量對(duì)比分析，以差異倍數(shù)≥2或≤1/2且錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）≤0.01作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，獲得DEGs。

1.3.6.3 差異表達(dá)基因功能注釋及富集分析

對(duì)篩選獲得的Na2SeO3誘導(dǎo)組和對(duì)照組間的DEGs：1）通過(guò)BLAST2 GO比對(duì)到基因本體（Gene Ontology，GO）數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.geneontology.org/），再通過(guò)topGO進(jìn)行DEGs功能的GO富集[20]；2）通過(guò)KAAS（KEGG automatic annotation server）比對(duì)到KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數(shù)據(jù)庫(kù)，再采取超幾何分布樣本抽取方法進(jìn)行DEGs功能的KEGG代謝通路富集[21-22]，進(jìn)一步注解與GSH代謝調(diào)控相關(guān)基因、關(guān)鍵合成酶及其代謝途徑。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

轉(zhuǎn)錄組樣品設(shè)置2 個(gè)平行重復(fù)，其他樣本設(shè)置3 個(gè)平行重復(fù)，使用SPSS 20.0對(duì)所檢測(cè)的多形漢遜酵母生長(zhǎng)及其GSH產(chǎn)量進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，以P＜0.05計(jì)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 Na2SeO3對(duì)多形漢遜酵母生長(zhǎng)影響

以細(xì)胞計(jì)數(shù)和發(fā)酵液吸光度分別考察多形漢遜酵母DL-1菌體增長(zhǎng)情況，結(jié)果在1×104～1×1010個(gè)/mL范圍，酵母細(xì)胞數(shù)目和發(fā)酵液OD600nm值呈良好的線性關(guān)系，擬合方程為y=0.095 8x+0.729 8，R2＝0.986 3，P＜0.001（圖1A），因此，可用OD600nm間接表示酵母菌體濃度。在24 h發(fā)酵期內(nèi)，≤100 μmol/L的Na2SeO3可以促進(jìn)HP-DL-1生長(zhǎng)，而＞100 μmol/L的Na2SeO3抑制HPDL-1生長(zhǎng)，其生長(zhǎng)抑制EC50為234.72 μmol/L（圖1B）。將HP-DL-1以5%的接種量接種于含不同濃度Na2SeO3的發(fā)酵培養(yǎng)基中，200 r/min，37 ℃發(fā)酵12 h，然后置于30 ℃繼續(xù)發(fā)酵60 h；如圖1C所示，0～120 μmol/L的Na2SeO3可促進(jìn)HP-DL-1生長(zhǎng)，60 μmol/L發(fā)酵48 h菌體質(zhì)量濃度最高，達(dá)（40.29±0.64）g/L；而240 μmol/L和480 μmol/L的Na2SeO3延遲酵母進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間，抑制HP-DL-1生長(zhǎng)。不同濃度Na2SeO3誘導(dǎo)培養(yǎng)多形漢遜酵母DL-1發(fā)酵液中GSH的總產(chǎn)量如圖1D所示，隨著發(fā)酵時(shí)間延伸，酵母發(fā)酵液中GSH的積累逐漸增高，在48～54 h達(dá)到高峰。

圖 1 Na2SeO3對(duì)多形漢遜酵母DL-1生長(zhǎng)及GSH總產(chǎn)量的影響Fig. 1 Effects of Na2SeO3 on the growth and GSH yield of HP-DL-1

2.2 Na2SeO3對(duì)多形漢遜酵母GSH總產(chǎn)量的影響

表 1 不同濃度Na2SeO3對(duì)多形漢遜酵母DL-1 GSH產(chǎn)量的影響Table 1 Effect of different concentrations of Na2SeO3 on GSH production of HP-DL-1

如表1所示，當(dāng)Na2SeO3終濃度為60 μmol/L時(shí)，HP-DL-1發(fā)酵液GSH總產(chǎn)量最高，為（530.22±9.6）mg/L。隨著發(fā)酵液中Na2SeO3濃度增加，Na2SeO3對(duì)HPDL-1由營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)為毒性作用，抑制菌體生長(zhǎng)。當(dāng)Na2SeO3濃度為240 μmol/L時(shí)，HP-DL-1胞內(nèi)GSH含量最高，達(dá)（15.03±0.34）mg/g，但發(fā)酵液總GSH產(chǎn)量降低，為（286.34±9.6）mg/L。

2.3 RNA-seq數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估

60 μmol/L Na2SeO3能有效促進(jìn)多形漢遜酵母DL-1生長(zhǎng)，發(fā)酵48～54 h后胞內(nèi)GSH產(chǎn)量較高，因此，本研究將HP-DL-1種子液以5%的接種量分別轉(zhuǎn)接到Na2SeO3終濃度為0 μmol/L（對(duì)照組）和60 μmol/L（誘導(dǎo)組）的發(fā)酵培養(yǎng)液中，37～30 ℃、200 r/min培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期；提取RNA、構(gòu)建文庫(kù)并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。利用Fast QC（v 0.10.1）法分析測(cè)序質(zhì)量，測(cè)序的堿基質(zhì)量值用Qphred表示，樣品測(cè)序數(shù)據(jù)如表2所示，對(duì)照組獲得45 778 342 Clean reads，誘導(dǎo)組得到45 492 098 Clean reads，4 個(gè)轉(zhuǎn)錄組樣本中Q30（0.1%堿基識(shí)別錯(cuò)誤率）最小的樣本值為95.28%，序列GC含量47.96%，表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量較高。

使用Trinity軟件將短的reads拼接組裝為較長(zhǎng)的Unigene序列集；將Clean reads與Unigene序列進(jìn)行比對(duì)，得到Mapped Data；結(jié)果顯示，測(cè)序4 個(gè)樣本定位到Unigene序列上的序列數(shù)均大于80%，最低匹配率為84.65%，表明本測(cè)序樣本沒(méi)有受到污染。

表 2 Na2SeO3誘導(dǎo)多形漢遜酵母DL-1的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量分析Table 2 Quality statistics of transcriptome sequencing of HP-DL-1 induced by Na2SeO3

2.4 差異表達(dá)基因

采用Bowtie結(jié)合RSEM進(jìn)行基因表達(dá)量水平估計(jì)；以FPKM計(jì)算各個(gè)基因相對(duì)表達(dá)量，以基因FC≥2或FC≤1/2且FDR≤0.01作為篩選條件，進(jìn)行Na2SeO3誘導(dǎo)組與對(duì)照組多形漢遜酵母的差異表達(dá)分析。如圖2所示，橫坐標(biāo)表示基因在不同樣本中表達(dá)倍數(shù)變化，縱坐標(biāo)表示基因表達(dá)量變化差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，Na2SeO3誘導(dǎo)組與對(duì)照組多形漢遜酵母之間有1 254 個(gè)顯著性DEGs，其中630 個(gè)DEGs表達(dá)顯著上調(diào)，624 個(gè)DEGs表達(dá)顯著下調(diào)，說(shuō)明Na2SeO3對(duì)多形漢遜酵母DL-1的基因轉(zhuǎn)錄水平產(chǎn)生了廣泛的影響。

圖 2 Na2SeO3誘導(dǎo)組和對(duì)照組比較的差異表達(dá)基因Fig. 2 DEGs between Na2SeO3 induced and control groups

2.5 差異表達(dá)基因GO富集分析

對(duì)獲得的Na2SeO3誘導(dǎo)組和對(duì)照組間1 254 個(gè)顯著DEGs進(jìn)行GO數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，其中639 個(gè)DEGs獲得GO功能注釋，再通過(guò)topGO進(jìn)行DEGs的GO富集分析，639 個(gè)DEGs在GO功能二級(jí)分類下共涉及12 個(gè)生物過(guò)程（biological process，BP），10 個(gè)細(xì)胞組分（cellular component，CC），12 個(gè)分子功能（molecular function，MF）（圖3）。生物學(xué)過(guò)程功能分組中包括106 個(gè)DEGs，主要涉及代謝過(guò)程、細(xì)胞過(guò)程和單有機(jī)體過(guò)程；在細(xì)胞組分的功能分組中包括63 個(gè)DEGs，主要涉及細(xì)胞、細(xì)胞組分、細(xì)胞膜組分和細(xì)胞器組分；在分子功能分組中包括470 個(gè)DEGs，主要涉及催化活性、結(jié)合、轉(zhuǎn)運(yùn)活性等功能。

圖 3 差異表達(dá)基因的GO富集Fig. 3 GO enrichment of DEGs between Na2SeO3 induced and control groups

圖 4 差異表達(dá)基因的GO富集柱狀圖Fig. 4 Go enrichment histogram of DEGs between Na2SeO3 induced and control groups

進(jìn)一步分析表明，639 個(gè)DEGs在GO功能分類下共涉及838 個(gè)GO term，選擇富集最顯著的30 個(gè)GO term，繪制GO富集柱狀圖（圖4），縱坐標(biāo)為富集的GO term，橫坐標(biāo)為該term中差異基因的個(gè)數(shù)，富集最顯著主要涉及26 個(gè)生物過(guò)程和4 個(gè)細(xì)胞組分，包括細(xì)胞膜（92 個(gè)DEGs）和細(xì)胞核組分（71 個(gè)DEGs），跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)（77 個(gè)DEGs）、DNA修復(fù)（22 個(gè)DEGs）、DNA復(fù)制（9 個(gè)DEGs）、DNA重組（12 個(gè)DEGs）過(guò)程，RNA剪切過(guò)程（5 個(gè)DEGs）、蛋白質(zhì)糖基化（14 個(gè)DEGs）、磷脂生物合成（9 個(gè)DEGs）、絲氨酸/蘇氨酸激酶調(diào)節(jié)（2 個(gè)DEGs）和GSH生物合成過(guò)程（2 個(gè)DEGs）等。

2.6 差異表達(dá)基因KEGG代謝通路富集

圖 5 差異表達(dá)基因的KEGG通路富集Fig. 5 KEGG pathway enrichment of DEGs between Na2SeO3 induced and control groups

將獲得的Na2SeO3誘導(dǎo)組和對(duì)照組間DEGs比對(duì)到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)超幾何分布樣本抽取方法進(jìn)行DEGs功能的KEGG代謝通路富集，1 254 個(gè)顯著DEGs中有649 個(gè)基因被KEGG注釋，參與94 條代謝途徑。選擇富集最顯著的50 個(gè)KEGG通路（圖5），包括氨基酸的生物合成（40 個(gè)DEGs）、碳代謝（39 個(gè)DEGs）、糖酵解/糖異生（22 個(gè)DEGs）、核酸代謝（嘌呤21 個(gè)DEGs、嘧啶14 個(gè)DEGs）、甲烷代謝（20 個(gè)DEGs）、脂肪酸代謝（11 個(gè)DEGs）等代謝通路；酵母細(xì)胞周期（24 個(gè)DEGs）、有絲分裂等細(xì)胞過(guò)程（18 個(gè)DEGs）；以及核糖體（27 個(gè)DEGs）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工（23 個(gè)DEGs）的遺傳信息處理通路。其中，參與核糖體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工等遺傳信息處理通路調(diào)控的基因?yàn)榈鞍踪|(zhì)合成和細(xì)胞有絲分裂做好準(zhǔn)備；調(diào)控有絲分裂和細(xì)胞周期等細(xì)胞過(guò)程的調(diào)控基因與Na2SeO3誘導(dǎo)酵母細(xì)胞快速增值，提高發(fā)酵產(chǎn)率密切相關(guān)；碳、核酸、脂肪酸代謝過(guò)程相關(guān)基因保障細(xì)胞代謝維持穩(wěn)定并為促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖提供物質(zhì)和能量；而參與調(diào)控氨基酸的生物合成，尤其是參與GSH合成密切相關(guān)的丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝通路，半胱氨酸和蛋氨酸代謝通路，以及GSH代謝通路的酶基因，其轉(zhuǎn)錄水平在Na2SeO3誘導(dǎo)組和對(duì)照組酵母之間呈現(xiàn)顯著的差異。

2.7 GSH代謝相關(guān)的差異表達(dá)基因

GSH合成和代謝是由一些列酶催化介導(dǎo)的生化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)對(duì)比分析差異表達(dá)基因GO富集和KEGG富集的結(jié)果，篩選2 組結(jié)果中高富集通路中共有的，并且參與調(diào)控GSH合成代謝的顯著差異表達(dá)的酶基因，分析結(jié)果如表3所示。在Na2SeO3誘導(dǎo)發(fā)酵的多形漢遜酵母中，絲氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶（serine-pyruvate transaminase，SGX1）、丙氨酸乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶（alanineglyoxylate aminotransferase，MET6）、GSH合成酶（glutathione synthase，GSH-II）、磷酸葡萄糖酸脫氫酶（6-phosphogluconate dehydrogenase，GND1）、5-氧丙烷酶（5-oxoprolinase，OXP1）和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（gamma-glutamyl-transpeptidase，ECM38）表達(dá)上調(diào)。Sahu等[23]研究表明SGX1和MET6可以通過(guò)順序的轉(zhuǎn)氨基作用，將羥基丙酮酸轉(zhuǎn)化為絲氨酸，再轉(zhuǎn)化為甘氨酸；甘氨酸經(jīng)過(guò)GSH-II催化與谷氨酰半胱氨酸合成GSH[24]；GND1通過(guò)促進(jìn)NADPH脫氫為NADP+，維持GSH的還原態(tài)[25]；OXP1和ECM38促進(jìn)GSH-5異脯氨酸-谷氨酸的循環(huán)代謝[26]；因此這些基因在Na2SeO3作用下轉(zhuǎn)錄水平增高，可以有效促進(jìn)酵母細(xì)胞合成大量GSH，并保持GSH的還原態(tài)。

表 3 GSH代謝相關(guān)的差異表達(dá)基因Table 3 DEGs related to glutathione metabolism

另一方面，在Na2SeO3誘導(dǎo)發(fā)酵的多形漢遜酵母中，谷氨酸合酶、谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GLN1）和GSH-S-轉(zhuǎn)移酶（glutathioneS-transferase，GSTs）表達(dá)下調(diào)，通過(guò)減少谷氨酸進(jìn)入谷氨酸-谷氨酰循環(huán)比例[26]，抑制胞內(nèi)GSH酶解為谷氨酸、甘氨酸和乙酰CoA[27]，促進(jìn)GSH在細(xì)胞內(nèi)積累。

此外，低能離子注入的重組酵母[28]、柱狀黏滑菇菌[29]（Hebeloma cylindrosporum）、酒酒球菌[9]（Oenococcus oeni）等其他微生物中參與調(diào)控GSH合成的關(guān)鍵酶，如γ-谷氨酰基轉(zhuǎn)移酶、GSH還原酶、GSH水解酶，其基因轉(zhuǎn)錄在本研究中表達(dá)無(wú)顯著差異，這可能與誘導(dǎo)方式或菌種基因型不同有關(guān)，其具體原因還有待進(jìn)一步研究探索。

3 結(jié) 論

本研究考察高密度、變溫培養(yǎng)條件下，添加Na2SeO3誘導(dǎo)多形漢遜酵母合成GSH的發(fā)酵過(guò)程，發(fā)現(xiàn)60 μmol/L Na2SeO3可以誘導(dǎo)多形漢遜酵母合成GSH總產(chǎn)量提高，達(dá)到（530.22±9.6）mg/L。采用Illumina HiSeq測(cè)序平臺(tái)對(duì)Na2SeO3誘導(dǎo)組與對(duì)照組多形漢遜酵母轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行對(duì)比分析，按照差異基因表達(dá)變化2 倍以上且FDR≤0.01的原則，兩組間共篩選出1 254 個(gè)DEGs，其中630 個(gè)基因上調(diào)，624 個(gè)基因下調(diào)。通過(guò)差異基因GO富集分析結(jié)果可以明確Na2SeO3可以誘導(dǎo)酵母中參與跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞壁生成等細(xì)胞過(guò)程的功能基因，以及調(diào)控蛋白糖基化、基因甲基化、絲氨酸/蘇氨酸和GSH合成的酶基因的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生顯著變化。最后通過(guò)差異基因KEGG富集分析確定差異表達(dá)基因在酵母細(xì)胞周期、碳代謝、氧化磷酸化、氨基酸的生物合成，尤其是谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸及GSH代謝通路中顯著富集。本研究部分解析了Na2SeO3誘導(dǎo)多形漢遜酵母菌高產(chǎn)GSH的生理機(jī)制，同時(shí)也為進(jìn)一步提高酵母GSH產(chǎn)量及其分子育種提供參考數(shù)據(jù)。