產細菌素屎腸球菌的篩選鑒定及其抑菌特性

張 明，羅 強，魏 婕，劉 巧，羅 璠

（西南民族大學生命科學與技術學院，青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部重點實驗室，四川 成都 610041）

屎腸球菌是人和動物腸道內的常見菌種，也是發酵食品中的正常菌種，在飼料、醫藥和食品中發揮著重要作用。屎腸球菌是我國農業部發布的《飼料添加劑品種目錄（2013）》中的益生菌之一，能提高畜禽的生長性能和營養物質的消化率[1]，降低糞便中病原微生物的數量[2-3]；屎腸球菌也用于調節人的腸道菌群，治療因腸道菌群失調引起的腹瀉[4]。屎腸球菌在發酵食品中得到了廣泛應用： Moreno等[5]將屎腸球菌DPC 1146作為發酵劑添加到切達干酪中，提高了干酪成熟過程中的穩定性；Pingitore等[6]將屎腸球菌添加到新鮮米納斯奶酪中，延長了奶酪的保質期。

腸球菌素是腸球菌核糖體合成機制產生的一類具有抗菌活性的蛋白質類物質的統稱，1975年，Kramer等[7]首次報道了屎腸球菌E1可以產生細菌素enterocin E1，到目前為止已經報道了很多產細菌素的屎腸球菌[8-9]。屎腸球菌素應用最廣泛的主要有enterocin A和enterocin B[10]，屬于II類細菌素，這類細菌素為小分子多肽或蛋白質，具有良好的熱穩定性和廣譜抑菌性，對單核細胞性李斯特菌具有很強的抑制作用。屎腸球菌素常被用于肉制品和乳制品防腐。Chakchouk-Mtibaa等[11]的研究表明，在4 ℃保存的火雞肉樣品中添加屎腸球菌素BacFL 31，可以延長火雞肉保質期并增強感官屬性。Vandera等[12]研究表明，將屎腸球菌KE82添加到牛奶中可以產生enterocin A和enterocin B，抑制李斯特菌的生長，延長了牛奶的保質期。

益生菌商業化的關鍵因素之一是其能否長期維持遺傳穩定。近幾年對于益生菌的遺傳穩定性有相關研究，Min等[13]針對基因組進行研究，發現兩歧雙歧桿菌和長雙歧桿菌在連續傳代過程中整個基因組序列保持高度的遺傳穩定性；孔亞楠[14]對1 株植物乳桿菌進行了4 000 代連續傳代，發現菌株在連續傳代過程中，細胞形態、碳水化合物代謝能力、對腸胃液和膽鹽的耐受性及自凝集能力保持高度的遺傳穩定性。但是關于細菌素遺傳穩定性的研究鮮有報道。本研究擬從四川紅原地區采集的傳統發酵乳樣中，篩選高產抑菌物質的乳酸菌。通過對菌株所產細菌素的生物學特性、遺傳穩定性及抑菌特性的研究，篩選遺傳穩定的高產菌株，以期為后期工業開發提供備選菌種。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來源

傳統發酵酸奶樣品8 份，均采自四川阿壩州紅原縣。

1.1.2 指示菌

大腸桿菌ATCC 8099、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞性李斯特菌、植物乳桿菌、短乳桿菌、禾谷鐮刀霉菌、鞘氨醇單胞菌、海氏腸球菌、耐久腸球菌，以上非標準菌株均為本實驗室篩選鑒定保藏。

1.1.3 培養基與試劑

MRS培養基、改良MC培養基、LB培養基 青島海博生物技術有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒天根生化科技有限公司；中性蛋白酶、堿性蛋白酶、蛋白酶K、酸性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、過氧化氫酶德國Biofroxx公司；乳酸鏈球菌素 北京索萊寶生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

ST16R高速冷凍離心機 賽默飛世爾科技有限公司；GH6000電熱恒溫培養箱 天津泰斯特設備有限公司；ETC811基因擴增聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 北京東勝創新生物科技有限公司；Tanon2500凝膠成像系統 中國天能公司；Vortex-BE1旋渦混合器 江蘇其林貝爾儀器制造有限公司；UV1900紫外-可見分光光度計 上海佑科儀器公司；ELX-800酶標儀 美國伯騰儀器有限公司；R40-IIB2超凈工作臺 中國青島海爾有限公司；GI54DW高壓蒸汽滅菌鍋 廈門致微儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離純化

取1 mL酸奶于10 mL滅菌的EP管中，采用10 倍稀釋法進行梯度稀釋，選取100 μL 10-3～10-5稀釋度的樣品涂布于滅菌的改良MC培養基上，30 ℃靜置培養24～48 h。挑取產生鈣溶圈的菌落，在MRS固體培養基中反復劃線培養直至單菌落，將分離得到的菌株進行革蘭氏染色和觸酶實驗，革蘭氏陽性且觸酶陰性的菌株作為后續篩選的出發菌株，保藏備用。

1.3.2 發酵上清液制備

將菌株接種于MRS液體培養基，30 ℃靜置培養24 h，將發酵液于6 000 r/min、4 ℃離心15 min，取上清液，用1 mol/L HCl溶液和1 mol/L NaOH溶液將上清液pH值調至6.0，用0.22 μm無菌濾膜過濾，4 ℃冷藏備用。

1.3.3 產細菌素乳酸菌的篩選

1.3.3.1 96 孔板初篩

以標準菌株為指示菌，采用96 孔板法測定菌株發酵液的抑菌效果[15]。取15 μL指示菌菌懸液（108CFU/mL）和185 μL菌株發酵上清液，置于無菌96 孔細胞培養板中，30 ℃靜置培養12 h，用酶標儀測定OD600nm值，以等量指示菌接種于空MRS培養基為空白對照，按下式計算抑菌率。抑菌率達到50%及以上的菌株進一步復篩。

式中：OD1表示指示菌在乳酸菌發酵上清液中培養12 h后的OD600nm值；OD2表示指示菌在空白MRS培養基中培養12 h后的OD600nm值。

1.3.3.2 平板打孔法復篩

采用平板打孔法測定抑菌活性[16]：用1.5%的素瓊脂10 mL鋪底層，晾干后上面均勻放置牛津杯，將含108CFU/mL的指示菌菌液100 μL加入到10 mL的LB培養基中，混勻后倒入平板，晾干后取出牛津杯，每個孔內加入100 μL的發酵上清液，冰箱中放置2 h擴散，37 ℃靜置培養5～12 h，用游標卡尺測量抑菌圈直徑。以乳酸鏈球菌素作為陽性對照，以無菌水為陰性對照，以大腸桿菌ATCC 8099和金黃色葡萄球菌作為指示菌（后續的平板抑菌實驗，未特殊說明的均以此設置陰性對照、陽性對照和指示菌）。

1.3.4 H2O2排除

將過氧化氫酶溶解并按照終質量濃度為1 mg/mL添加到菌株發酵上清液中，37 ℃水浴2 h后沸水浴煮沸5 min使酶滅活，用平板打孔法測定其抑菌活性[17]。

1.3.5 形態觀察與生理生化鑒定

對SC-Y12進行形態學觀察及生理生化實驗。將菌株在MRS固體培養基30℃靜置培養24 h，觀察菌落形態。美蘭牛奶生長實驗、溶明膠實驗、吲哚實驗和糖發酵實驗參照文獻[18-19]。

1.3.6 基因同源性分析

1.3.6.1 16S rDNA序列同源性分析

用細菌基因組DNA提取試劑盒提取細菌總DNA，PCR擴增16S rDNA基因片段。16S rDNA引物序列[20]：上游引物Eu27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；下游引物1541R：5’-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’。PCR擴增體系：采用25 μL體系，DNA模板1 μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL，2×TaqMaster Mix預混酶12.5 μL，無菌雙蒸水7.5 μL。PCR擴增程序：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，循環30 次，72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。

凝膠電泳檢驗合格后送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。將測序結果拼接后在NCBI中進行同源性比對，選取GenBank數據庫中同源性達99%以上的部分序列進行比對。

1.3.6.2rpoA序列同源性分析

以菌株的DNA基因組為模板，將其管家基因RNA聚合酶α亞基基因進行擴增。rpoA引物序列[21]：上游引物rpoA-21-F：5’-ATGATYGARTTTGAAAAACC-3’；下游引物rpoA-23-R：5’-ACHGTRTTRATDCCDGCRCG-3’。PCR擴增體系：采用25 μL體系，DNA模板1 μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL，2×TaqMaster Mix預混酶12.5 μL，無菌雙蒸水7.5 μL。PCR擴增程序：95 ℃預變性5 min，3 次循環（95 ℃變性60 s，46 ℃退火135 s，72 ℃延伸75 s），30 次循環（95 ℃變性35 s，46 ℃退火75 s，72 ℃延伸75 s），72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

凝膠電泳檢測擴增產物合格后將PCR產物送交生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。序列與GenBank中已知菌株的rpoA基因序列進行同源性分析，用MEGA 7.0軟件構建系統發育樹。根據16S rDNA及ropA序列同源性分析對菌株進行菌種鑒定。

1.3.7 抑菌活性與生長量測定

將菌株以1%的接種量轉入MRS液體培養基中，30 ℃靜置培養24 h，每2 h取樣一次，測定OD600nm，采用96 孔板法測定發酵上清液的抑菌活性，繪制菌株抑菌活性曲線和生長曲線。

1.3.8 遺傳穩定性分析

將菌株以1%的接種量接種到MRS液體培養基進行連續傳代，取每個傳代周期第16小時的發酵液制備發酵上清液，用96 孔板法測定其抑菌活性，檢測該菌株在傳代過程中抑菌性能的穩定性。

1.3.9 抑菌物質特性分析

1.3.9.1 pH值敏感性

將菌株的發酵上清液調節到pH 3.0、5.0、6.0、7.0、9.0，室溫放置30 min，再將pH值回調到pH 6.0，用平板打孔法測定發酵液的抑菌活性，以pH 6.0的發酵上清液作為對照。

1.3.9.2 蛋白酶的敏感性

將菌株的發酵上清液分別用酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、蛋白酶K在酶最適的作用條件下溫浴處理30 min，冷卻至室溫，將pH值調節到6.0，平板打孔法測定發酵上清液的抑菌活性，以未加蛋白酶處理的發酵上清液（pH 6.0）作為對照。

1.3.9.3 熱穩定性

將菌株的發酵上清液分別在60、80、100 ℃條件下水浴30 min，冷卻至室溫，采用平板打孔法測定發酵液的抑菌活性，以室溫條件下處理的發酵上清液作為對照。

1.3.10 抑菌譜的測定

采用平板打孔法測定發酵上清液對各種指示菌的抑菌效果，保證指示菌細菌的終濃度為106CFU/mL，霉菌的終濃度為104CFU/mL[22]。

1.4 數據分析和處理

2 結果與分析

2.1 菌株的分離篩選

通過革蘭氏染色、觸酶實驗以及改良MC培養基鈣溶圈篩選，從8 份樣品中共分離得到308 株供試菌株。通過菌種的初篩和復篩，最后選取1 株對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有明顯穩定抑菌效果的菌株（圖1），編號為SC-Y112，作為后續研究的出發菌株。

圖 1 平板抑菌結果Fig. 1 Results of antibacterial tests on agar plates

2.2 H2O2排除

通過H2O2排除實驗發現，用過氧化氫酶排除H2O2后菌株的抑菌能力幾乎沒有變化（P＞0.05），結果如表1所示，說明發酵上清液的抑菌效果不是由于H2O2造成的。

表 1 H2O2對菌株抑菌性能的影響Table 1 Effect of H2O2 on the antibacterial properties of the strain

2.3 菌株鑒定

2.3.1 形態觀察和生理生化實驗

菌株在MRS固體培養基生長時形成的菌落直徑為0.2～0.3 mm，表面光滑，質地均勻，乳白色。菌株在美蘭牛奶中培養48 h，美蘭牛奶褪色，糖發酵實驗結果如表2所示。

表 2 生理生化特性Table 2 Physiological and biochemical characteristics of the strain

2.3.2 16S rDNA序列同源性分析

通過16S rDNA基因序列測定（NCBI序列號為MT032338）及同源性分析，發現該菌株與腸球菌屬的同源性均高達99%以上。16S rDNA序列鑒定能確定該菌株是腸球菌屬，但不能確定該菌株的種水平，因此采用管家基因進一步鑒定。

2.3.3rpoA序列同源性分析

圖 2 SC-Y112的ropA基因序列系統進化樹Fig. 2 Phylogenetic tree of strain SC-Y112 based on ropA gene sequence

將菌株的rpoA基因測序并進行序列同源性分析，進一步構建了菌種的系統進化樹，結果如圖2所示。該菌株與標準菌株屎腸球菌（Enterococcus faecium）聚為一類。結合菌落形態和生理生化實驗結果、16S rDNA基因以及rpoA基因序列分析，判定該菌株為屎腸球菌。

2.4 抑菌活性與生長量測定結果

細菌素的產生與其菌株生長具有一定的關聯，研究表明細菌素的產生一般在對數生長期[23-24]。菌株SC-Y112的生長和細菌素代謝曲線如圖3所示，菌株在接種后4 h開始進入對數生長期，16 h進入穩定期。菌株對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果較為一致，均是在接種后6 h開始分泌抑菌活性物質，在12 h抑菌活性達到較高值并保持穩定，20 h后抑菌活性開始下降。這可能是由于在酸性條件下抑菌物質能吸被產生菌細胞表面吸附[25]，或者抑菌物質被胞外蛋白酶水解，從而引起了發酵液中抑菌活性物質濃度下降。

圖 3 菌株生長量與抑菌活性的關系Fig. 3 Relationship between SC-Y112 growth and its antibacterial activity

2.5 遺傳穩定性分析

通過生長曲線測定，發現SC-Y112以16 h為一個傳代周期，在每個傳代周期內，菌體數量以接近指數形式（2n）增殖，即一個傳代周期內的生長代數（細菌進行分裂的次數）為log2100≈6.64 代[26]。將菌株連續傳代至110 代，檢測每個世代的菌株發酵上清液（16 h）的抑菌活性，結果如表3所示。在13～80 代之間抑菌活性保持穩定，在86 代以后抑菌活性有明顯下降（P＜0.05），但仍保持約80%抑菌活性。白梅[26]的研究證明干酪乳桿菌（Lactobacillus caseiZhang）在2 000 代的傳代中其表型特征，對胃液、腸液、膽汁的耐受性均保持穩定，基因組突變率也較低，說明有良好的穩定性。劉衍芬[27]研究嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌，在連續傳代至約85 代時表型特征、發酵性能、隨機擴增多態性DNA標記（random amplified polymorphic DNA，RAPD）、全蛋白質十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）均無顯著變化；但在傳代至約113 代時，嗜熱乳桿菌的全細胞蛋白質電泳圖譜顯示有一些高分子質量的蛋白質不再表達，保加利亞乳桿菌RAPD和全蛋白質SDS-PAGE均有變化。本研究表明抑菌物質在86 代以后出現明顯下降，可能是由菌種衰退造成，具體原因有待進一步分析。

2.6 抑菌物質特性分析

2.6.1 pH值穩定性

如表4所示，發酵上清液在pH 9.0條件下處理后，不顯示抑菌活性，在pH 3.0～7.0范圍內處理后仍表現抑菌活性，但隨著pH值的上升抑菌活性明顯下降（P＜0.05），說明該菌株所產的抑菌物質在酸性條件下較穩定，而在堿性條件下不穩定，該結果與前期很多研究結果相似[28-30]。

表 4 不同pH值處理發酵上清液的抑菌活性Table 4 Diameters of inhibition zones of the fermentation supernatant under different pH conditions

2.6.2 酶的敏感性

表 5 不同蛋白酶處理發酵上清液的抑菌活性Table 5 Diameters of inhibition zones of the fermentation supernatant after being treated with diffeent proteases

如表5所示，SC-Y112的發酵上清液經蛋白酶K處理后抑菌效果完全消失，可以初步判斷SC-Y112所產的抑菌物質屬于蛋白質性質。而SC-Y112的抑菌物質表現出對酸性蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶的敏感性，與多數研究結果[31]一致，結合pH值穩定性實驗推測SC-Y112產生的抑菌活性物質可能在堿性條件下不穩定，因而出現堿性酶處理后活性消失，也可能是被胰蛋白酶水解而造成的活性消失；而該種物質能夠被酸性蛋白酶類水解從而失去活性。該抑菌物質表現出對中性蛋白酶作用不敏感，該特性與尚楠等[32]報道的1 株雙歧桿菌所產細菌素的性質相似。

2.6.3 熱穩定性

表 6 高溫處理發酵上清液的抑菌活性Table 6Diameters of inhibition zones of the high temperature-treated fermentation supernatant

如表6所示，SC-Y112發酵上清液在高溫處理后仍具有抑菌效果，在100 ℃處理30 min后對指示菌仍具有約87%的抑菌效果，溫度對SC-Y112發酵上清液的抑菌效果影響不顯著（P＞0.05），說明SC-Y112發酵上清液中的抑菌物質有較好的耐熱性。大量研究也證明了細菌素具有良好的熱穩定性[33-34]，能在100 ℃甚至121 ℃條件下仍保持穩定。

2.7 抑菌譜測定結果

表 7 屎腸球菌發酵上清液的抑菌譜Table 7 Antibacterial spectrum of the fermentation supernatant of E. faecium

由表7可見，抑菌譜實驗表明，SC-Y112產生的抑菌物質具有一定的廣譜抑菌性，對部分革蘭氏陽性指示菌（金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、單核細胞性李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌）和革蘭氏陰性指示菌（大腸桿菌、沙門氏菌、鞘氨醇單胞菌）均具有較好的抑菌效果，其中對單核細胞性李斯特菌的抑菌效果最好，對霉菌沒有抑制效果。屎腸球菌產生的細菌素普遍能抑制革蘭氏陽性菌，尤其是單核細胞性李斯特菌，對金黃色葡萄球菌也有抑制效果[35]。而對革蘭氏陰性菌株和真菌的抑菌效果，則表現出差異，屎腸球菌TJUQ1[36]所產細菌素不僅能抑制大腸桿菌和沙門氏菌，而且還能抑制魯氏酵母；屎腸球菌ZJ19[37]能抑制革蘭氏陰性菌（大腸桿菌和沙門氏菌）；而屎腸球菌AS 1.2025[38]、屎腸球菌M-2[39]所產細菌素不抑制大腸桿菌。另外，本研究中菌株SC-Y112產生的細菌素對大腸桿菌（革蘭氏陰性菌）和金黃色葡萄球菌（革蘭氏陽性菌）的抑菌效果接近，這與許多研究結果[40]有所差異，造成這種差異的原因目前鮮見相關的殺菌機理的深入研究報道，需進一步探索。SC-Y112產生的抑菌物質對乳酸桿菌（植物乳桿菌和短乳桿菌）沒有抑制效果，這種抑菌特性與多數研究報道有差異[41]，這也是其在食品領域可能具有更好的應用效果。同時，SC-Y112對親緣關系更近的腸球菌（海氏腸球菌和耐久腸球菌）有抑制效果，相似的抑菌特性在許多研究中均有報道[42]，這種抑菌特性為多數細菌素所共有。

3 結 論

屎腸球菌是乳酸菌中腸球菌屬重要菌種，能發酵糖類產生多種酸、醇和細菌素，具有高產酸能力、抗氧化能力和拮抗致病菌等能力。大量研究表明屎腸球菌可以產生細菌素，從而在食品及飼料行業中廣泛應用。本研究從川西北阿壩地區傳統發酵酸奶中分離篩選出1 株具有較高抑菌活性的菌株SC-Y112，經過16S rDNA和rpoA序列同源性分析，結合菌落形態和生理生化實驗，鑒定為屎腸球菌。經過排酸及排除H2O2后，發酵上清液仍具有明顯抑菌特性，采用不同蛋白酶處理后，抑菌物質的抑菌活性出現下降或消失，確定該菌株產生的抑菌物質含有蛋白質成分，由于該物質具有較強的熱穩定性，初步推測其是一種小肽。通過菌株連續傳代實驗，證明該菌株在110 代內能保持較好的抑菌性，說明該菌株具有良好的遺傳穩定性，該抑菌物質在pH 3.0～7.0的條件下有較好的抑菌性，對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有一定抑菌效果。該菌株抑菌效果明顯，遺傳特性穩定，有望成為商業開發的備選菌株。