植物乳桿菌KLDS1.0391 PurR和PurL蛋白的原核表達、純化及其與細菌素合成啟動子的相互作用

李欣芮，趙 桉，范小飄，高文文，尚佳萃，趙鵬昊，趙 樂，周 雪，孟祥晨

（東北農業大學 乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030）

植物乳桿菌KLDS1.0391分離自內蒙古傳統發酵乳制品，能代謝產生對革蘭氏陽性菌和陰性菌都有抑制作用的細菌素[1]，2% NaCl脅迫可促進其細菌素合成[2]，轉錄組學分析表明，鹽脅迫時purR基因和purL基因表達顯著下調，推測其可能參與細菌素合成的調控作用。

purR基因編碼的PurR蛋白是嘌呤從頭生物合成途徑中的阻遏蛋白，對嘌呤生物合成途徑中11 個pur系列的結構基因具有轉錄調節作用。不同細菌中pur基因的分布和調控遵循不同的規則[3]，在革蘭氏陰性菌大腸桿菌中，嘌呤生物合成基因散布在染色體各處，在革蘭氏陽性菌枯草芽孢桿菌中，所有參與嘌呤合成的基因都分布在一個轉錄單元，即嘌呤操縱子[4]。關于植物乳桿菌purR的研究較少，但有研究表明乳酸乳球菌中的purR與枯草芽孢桿菌中的purR同源[5]。許多代謝調節蛋白具有雙重功能甚至是未被發現的功能，purR基因除對嘌呤生物合成具有重要的調控作用外，還對嘧啶合成途徑中的pyrC與pyrD基因、與Cysosine轉運吸收有關的codBA基因、編碼5-磷酸核糖焦磷酸合成酶的prs基因以及甘氨酸合成代謝和一碳單位合成的glyA基因和gcv操縱子等具有調控作用[6-7]。除此之外，近年研究表明，金黃色葡萄球菌中purR突變增強了其致病力[8]，進一步研究發現，purR突變體表現出的毒力增加與嘌呤合成無關，PurR能夠結合并調節嘌呤生物合成途徑之外的啟動子元件，作為一種轉錄因子，直接結合至毒力基因的啟動子，調節毒力相關基因的表達[9]。因此，PurR可能存在尚未被開發的功能。

purL基因也參與嘌呤生物合成途徑，對于腺嘌呤和硫胺素的生物合成是必需的。Hava等[10]已經證明其是肺炎鏈球菌中重要的毒力因子；Xia Yanfei等[11]研究發現由purL基因調控的嘌呤生物合成中間體可以影響枯草芽孢桿菌OKB105菌株的殺蟲活性；Alcantara等[12]發現purL基因突變會顯著降低流產布魯氏菌（Brucella abortus）的毒性；Maegawa等[13]報道了艱難梭菌（Clostridium difficile）毒素的產生與PurL底物的積累呈反比；Ge Xiuchun等[14]也發現purL基因與鏈球菌的生物膜形成有關；Liu Quanli等[15]還發現purL基因突變的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），其細菌素Subltilosin A的產量增加顯著，抑菌能力增強。可見，purL基因與微生物的生理活動有密切關系。

植物乳桿菌KLDS1.0391全基因組測序以及BLAST分析發現[16]，該菌包含4 個與細菌素合成相關的操縱子plnEFI、plnBD、plnGHSTUVW及plnXY，不同植物乳桿菌pln基因簇結構相似但不完全相同，但是所有的pln基因簇都具有非常相似的啟動子，每個操縱子的啟動子由2 個半保守的直接重復序列組成[17]，通過全基因組測序結果可以比對獲得植物乳桿菌KLDS1.0391中的plnE和plnG啟動子[18]。

用于研究啟動子與調控蛋白相互作用的常用方法有凝膠阻滯實驗（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）[19-20]、DNase I足跡法[21-22]、染色質免疫沉淀技術[23-25]以及近幾年發展起來的生物膜干涉（bio-layer interferometry，BLI）技術[26-27]等，能夠檢測啟動子核酸靶標與蛋白相互作用以及檢測二者之間的結合以及解離常數等。

本研究主要目的是通過體外分子相互作用的方法探究PurR和PurL蛋白能否與植物乳桿菌KLDS1.0391啟動子相結合，進而判斷這兩個蛋白是否直接參與細菌素合成的調控。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質粒

植物乳桿菌KLDS1.0391為東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室保藏；pMD?19-T克隆載體、大腸桿菌JM109感受態細胞 寶日醫生物技術（北京）有限公司；pQE-30表達載體、大腸桿菌M15感受態細胞華越洋生物（北京）科技有限公司。

1.1.2 試劑與培養基

質粒小提試劑盒、細菌基因組DNA提取試劑盒、通用型DNA純化回收試劑盒、TaqDNA Polymerase、D2000 DNA Marker 天根生化科技（北京）有限公司；PrimeSTAR?HS DNA Polymerase、DL5000 DNA Marker、DNA Ligation Kit、限制性內切酶KpnI、BamHI、HindIII 寶日醫生物技術（北京）有限公司；卡那霉素（Kana）、氨芐青霉素（Amp）、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG） 美國Amresco公司；Bradford蛋白質量濃度測定試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠快速配制試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5×）、Annealing Buffer for DNA Oligos（5×）、EMSA/Gel-Shift結合緩沖液（5×） 上海碧云天生物技術有限公司；預染彩虹蛋白Marker（10～190 kDa） 大連美侖生物技術有限公司；HisSep Ni-NTA Agarose Resin上海翊圣生物科技有限公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 美國Sigma公司；其他試劑為國產分析純。

LB培養基及MRS培養基配制方法參照文獻[28-29]。

1.2 儀器與設備

梯度聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 德國耶拿分析儀器股份公司；DYY-10C型電泳儀 北京市六一儀器廠；凝膠成像系統 美國UVP公司；QuickDrop超微量核酸蛋白分析儀、SpectraMax i3x多功能酶標儀、Octet RED96e分子互作分析系統美谷分子儀器（上海）有限公司；超聲波細胞粉碎機寧波新芝生物科技股份有限公司；蛋白純化柱 美國Thermo Fisher公司；蛋白質電泳儀、GelDoc EZ凝膠成像系統 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 引物的設計與合成

根據植物乳桿菌KLDS1.0391全基因組測序結果得到的purR和purL的基因序列，以及表達載體pQE-30質粒所包含的酶切位點，應用軟件Primer Premier 5.0設計引物。在purR基因上下游引物的5’端分別引入限制性內切酶KpnI和HindIII的酶切位點以及相應的保護堿基，purR基因上游引物（FR）為5’-GGGGTACCATGAAAGTACGTA GAAGCGAACG-3’（下劃線是KpnI酶切位點），下游引物（RR）為5’-CCCAAGCTTCTAGACTTCCGCACCGAA AAC-3’（下劃線是HindIII酶切位點）；在purL基因上下游引物的5’端分別引入限制性內切酶BamHI和HindIII的酶切位點以及相應的保護堿基，purL基因上游引物（FL）為5’-CGCGGATCCATGCTTAAAAAGCAACCATTATC-3’（下劃線是BamHI酶切位點），下游引物（RL）為5’-C CCAAGCTTTTACTTCAGTAGGCATGGTAAGG-3’（下劃線是HindIII酶切位點）。引物由吉林庫美生物科技有限公司合成。

1.3.2 重組克隆載體的構建與鑒定

用細菌基因組DNA提取試劑盒提取植物乳桿菌KLDS1.0391基因組DNA作為模板，進行PCR擴增。purR基因的擴增體系：DNA模板1 μL，上下游引物（10 μmol/L）各2 μL，高保真酶PrimeSTAR?HS DNA Polymerase（2.5 U/μL）0.5 μL，5×PrimeSTAR Buffer（Mg2+plus）10 μL，dNTP Mixture（各2.5 mmol/L）4 μL，dd H2O 30.5 μL，總體系50 μL。擴增過程：94 ℃預變性3 min，98 ℃變性10 s，63 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，30 個循環；72 ℃延伸10 min。purL基因擴增退火溫度為60 ℃，其余均與purR基因的擴增過程相同。擴增后使用通用型DNA純化回收試劑盒回收目的基因，在目的基因3’端加A堿基后，與克隆載體pMD 19-T simple按一定比例混合，于16 ℃連接，通過熱激法轉入大腸桿菌JM109感受態細胞，涂布于含有Amp的平板上，提取陽性菌落的質粒進行雙酶切鑒定，鑒定正確的重組子進行測序鑒定，分別命名為pMD 19-T simple-purR和pMD 19-T simple-purL。

1.3.3 重組表達載體的構建與鑒定

用質粒小提試劑盒提取堅定正確的質粒pMD 19-T simple-purR和pMD 19-T simple-purL，前者用KpnI和HindIII進行分步酶切，后者用BamHI和HindIII進行分步酶切，酶切后的產物進行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收目的基因purR和purL。將回收的目的基因與用相同酶處理后的pQE-30質粒按一定比例混合，于16 ℃連接，通過熱激法轉入大腸桿菌M15感受態細胞，涂布于含有Amp以及Kana的平板上，提取陽性菌落的質粒進行雙酶切鑒定，鑒定正確的重組子進行測序鑒定，分別命名為pQE-30-purR和pQE-30-purL。

1.3.4 PurR蛋白和PurL蛋白的誘導表達及鑒定

將鑒定正確的菌株pQE-30-purR和pQE-30-purL分別接種于含Amp 100 μg/mL和Kana 25 μg/mL的LB培養基中，37 ℃搖床振蕩培養至菌液OD600nm達到0.6～0.8時，加入IPTG（終濃度為0.5 mmol/L）進行蛋白表達，隔2 h取菌液離心收集菌體，菌體用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌后加入1/10原體積的PBS進行重懸，加入SDS-PAGE上樣緩沖液煮沸后用于SDS-PAGE分析。

1.3.5 PurR蛋白和PurL蛋白的純化與透析

PurR蛋白的純化與透析：按1%接種量將菌株pQE-30-purR接種至100 mL含Amp 100 μg/mL和Kana 25 μg/mL的LB培養基中，37 ℃搖床振蕩培養至菌液OD600nm達到0.6～0.8時，加入IPTG（終濃度為0.5 mmol/L）繼續培養6 h，8 000 r/min離心5 min收集菌體，PBS洗滌2 次后，加入10 mL裂解液（20 mmol/L Tris-HCl、0.5 mol/L NaCl、20 mmol/L咪唑，pH 7.9）進行超聲破壁處理（130 W 40%的功率，超聲5 s，靜置5 s），直至菌液澄清不黏稠，全程冰上操作。破壁后的菌液12 000 r/min離心10 min取上清液，上清液過0.45 μm濾膜后，加入平衡好的Ni-NTA純化柱中，輕輕攪動，室溫孵育0.5～1 h，用梯度咪唑濃度洗脫液（20 mmol/L Tris-HCl、0.5 mol/L NaCl，咪唑濃度分別為20、50、100、150、200、300、500 mmol/L，pH 7.9）洗脫并回收PurR蛋白。純化后的PurR蛋白加入準備好的透析袋中，于透析液（20 mmol/L Tris-HCl、0.5 mol/L NaCl，pH 7.9）中透析除去咪唑。

PurL蛋白的純化與透析：收集菌體后，加入10 mL PBS重懸，進行超聲破壁處理。破壁后的菌液12 000 r/min離心10 min棄上清液，沉淀用PBS洗滌2 次后，加入包涵體溶解液（20 mmol/L Tris-HCl、0.5 mol/L NaCl、8 mol/L尿素，pH 7.9）徹底溶解，過0.45 μm濾膜后，加入平衡好的Ni-NTA純化柱中，輕輕攪動，室溫孵育0.5～1 h，用梯度咪唑濃度洗脫液（20 mmol/L Tris-HCl、0.5 mol/L NaCl、8 mol/L尿素，咪唑濃度分別為20、50、100、150、200、300、500 mmol/L，pH 7.9）洗脫并回收PurL蛋白。純化后的PurL蛋白加入準備好的透析袋中，不斷降低透析液中的尿素濃度，使包涵體復性，最終透析至PBS中。

1.3.6 PurR蛋白和PurL蛋白的濃縮與定量

分別用10 kDa和30 kDa的超濾管濃縮PurR蛋白和PurL蛋白，12 000 r/min、4 ℃離心。濃縮后的蛋白用Bradford蛋白質量濃度測定試劑盒測定其濃度（標準品稀釋液與蛋白緩沖溶液保持一致）。

1.3.7 BLI實驗

1.3.7.1 Biotin-DNA制備

plnE啟動子的序列為5’-ACATTGGTATTTGAC GTTAAGAGAACGTTTTTTTACTTTTATAATTTTT TCAACAATCTGGTAAAA-3’，plnG啟動子的序列為5’-AAGCCTGATGAGGACATTTATCATAAAATTA TGTACGTTAATAGATAGTTGGCATACGATAACA TT-3’，均采用5’-biotin標記的方法。biotin-ss DNA與非標記的ss DNA均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，biotin-ss DNA與非標記的ss DNA退火形成biotin-ds DNA。退火體系：Nuclease-Free Water 40 μL，Annealing Buffer for DNA Oligos（5×）20 μL，DNA oligo A（50 μmol/L）20 μL，DNA oligo B（50 μmol/L）20 μL，總體積100 μL。退火程序：95 ℃、2 min；95 ℃、1.5 min；-1 ℃/cycle；70 個循環；16 ℃保存。

1.3.7.2 Octet RED96e分子互作分析系統上機實驗

將NTA傳感器插入PBS中預濕10 min以上，第1步將傳感器轉入A Buffer（PBS）中進行第1次基線步驟（baseline 1），第2步將傳感器轉入用A Buffer稀釋的PurL蛋白溶液（終質量濃度為160 μg/mL）中進行蛋白固化步驟（loading），第3步將傳感器轉入B Buffer（PBS+0.02% Tween+0.1% BSA）中進行第2次基線步驟（baseline 2），第4步將傳感器轉入用B Buffer稀釋的DNA溶液中進行結合步驟（association），第5步將傳感器轉回B Buffer中進行解離步驟（dissociation）。各步驟的時間根據基線平衡情況以及固化情況進行調整。PurR蛋白實驗時將第1步與第2步中的A Buffer換為C Buffer（20 mmol/L Tris-HCl、0.5 mol/L NaCl），蛋白固化步驟中PurR蛋白溶液終質量濃度為25 μg/mL。實驗設置DNA濃度梯度為86.2、43.1、21.5、10.75、5.37 nmol/L。

1.3.8 EMSA實驗

參考文獻[30]并進行部分調整。通過PCR擴增啟動子序列，純化回收后測定核酸濃度。蛋白和DNA結合反應體系中，5×EMSA結合緩沖液3 μL，DNA片段200～250 ng，不同濃度梯度純化后的蛋白，加入ddH2O補足至15 μL。室溫放置30 min后，加入2 μL EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液進行非變性蛋白電泳，結束后GelRed染色并用凝膠成像儀觀察。

2 結果與分析

2.1 重組克隆載體及重組表達載體的構建與鑒定

圖 1 重組克隆質粒以及重組表達質粒的酶切鑒定Fig. 1 Identification of recombinant cloned plasmids and recombinant expression plasmids by enzymatic digestion

針對構建的克隆載體pMD 19-T simple-purR和pMD 19-T simple-purL以及表達載體pQE-30-purR和pQE-30-purL，用相應的酶分別進行分步酶切鑒定，電泳結果顯示有兩條明亮條帶（圖1）。用pMD 19-T simple通用引物以及pQE-30測序引物進行測序，測序結果用BLAST工具與全基因組測序結果進行比對，序列完全一致，表明克隆載體pMD 19-T simple-purR和pMD 19-T simple-purL，以及表達載體pQE-30-purR和pQE-30-purL已成功構建。

2.2 PurR蛋白和PurL蛋白的誘導表達及鑒定

圖 2 PurR蛋白（A）和PurL蛋白（B）的SDS-PAGEFig. 2 SDS-PAGE analysis of expressed recombinant PruR (A) and PurL (B)

如圖2所示，與未誘導的菌體蛋白相比（泳道1），加入IPTG誘導劑后的菌體蛋白（2～7泳道）在箭頭處出現明顯的蛋白條帶，與軟件預測大小相近，PurR蛋白和PurL蛋白誘導表達成功。并且隨誘導時間的延長，重組蛋白的表達量增加，誘導6 h的PurR蛋白和PurL蛋白表達量較高，6 h后蛋白表達量增加不明顯，所以確定PurR蛋白和PurL蛋白的誘導時間為6 h。

2.3 PurR蛋白和PurL蛋白的純化與定量

20 mmol/L以及50 mmol/L咪唑洗脫液都不會洗脫目的蛋白，并可以洗脫少量雜蛋白（圖3）。對于PurR蛋白，200 mmol/L咪唑洗脫液就可以得到較高濃度的目的蛋白（圖3A）；對于PurL蛋白，咪唑濃度需達到300 mmol/L時才可得到較高濃度的蛋白（圖3B），經此方法純化的目的蛋白條帶較單一，純度較高。Bradford蛋白質量濃度測定試劑盒檢測純化后PurR蛋白質量濃度為0.74 mg/mL，PurL蛋白質量濃度為3.8 mg/mL，這是由于PurR蛋白是對破壁后的上清液進行純化，但部分PurR蛋白以包涵體形式存在，純化過程中會有部分損失，且在濃縮過程中濃度增加會有析出。

圖 3 PurR蛋白（A）和PurL蛋白（B）經不同咪唑濃度洗脫液洗脫的目的蛋白SDS-PAGEFig. 3 SDS-PAGE analysis of purified PruR (A) and PurL (B) with different concentrations of imidazole as eluent

2.4 BLI實驗結果

圖 4 啟動子與重組蛋白的結合實驗結果Fig. 4 BLI results for binding between promoters and recombinant proteins

單濃度預實驗結果表明，plnE啟動子與PurR蛋白和PurL蛋白可能存在結合作用，plnG啟動子與PurR蛋白可能存在結合作用，plnG啟動子與PurL不存在結合作用。所以對3 組可能存在相互作用的啟動子與表達蛋白進一步進行濃度梯度實驗，根據預實驗結果調整固化物PurR蛋白質量濃度為25 μg/mL，PurL蛋白質量濃度為160 μg/mL，分析物DNA濃度梯度為86.2、43.1、21.5、10.75、5.37 nmol/L。在association步驟以及dissociation步驟曲線平直，且DNA濃度不同時，結合與解離曲線基本重合，3 組濃度梯度實驗均沒有濃度依賴的結合解離過程（圖4），沒有觀察到PurR和PurL蛋白與plnE啟動子和plnG啟動子的直接相互作用。

2.5 EMSA實驗結果

EMSA檢測PurR、PurL蛋白與plnE、plnG啟動子的結合作用發現，與不加蛋白的對照組（泳道1）相比，無論何種蛋白質量濃度，DNA條帶均沒有出現滯后現象，沒有出現蛋白與啟動子片段結合的條帶（圖5）。結合BLI實驗結果，發現通過原核表達得到的PurR和PurL蛋白在體外沒有觀察到與植物乳桿菌KLDS1.0391細菌素合成調控區域的plnE和plnG啟動子直接的相互作用。

圖 5 重組蛋白與啟動子結合的EMSA實驗結果Fig. 5 EMSA results for recombinant proteins binding to promoters

3 討 論

研究表明，PlnC和PlnD是一對反應調節器，能夠調控植物乳桿菌細菌素的合成，磷酸化的PlnC和PlnD能夠結合到調控細菌素合成基因簇的啟動子上，激活或抑制細菌素合成相關基因的表達[31]。對植物乳桿菌KLDS1.0391鹽脅迫的初步研究發現，低濃度鹽能夠促進細菌素合成，但作用機制尚不明確，已有的細菌素調控機制無法解釋這種現象，在這一過程中是否存在其他相關調控蛋白與細菌素合成調控區域結合進而控制細菌素的合成尚不清楚。研究調控蛋白與核酸的結合作用，能夠更深入地理解基因表達調控過程，從分子層面進一步解釋微生物的各種生理活動。目前研究調控蛋白與核酸相互作用的實驗方法主要有體外與體內研究方法。徐會永[32]通過EMSA實驗證明通過原核表達的LeClp蛋白與pks/nrps基因的啟動子在體外具有結合作用；張良林等[26]通過BLI技術，在體外研究了原核表達的HetR蛋白與其靶DNA（PhetP與PhetZ）的結合情況及其結合親和力。體外實驗能夠直觀地顯示蛋白與核酸是否具有結合作用，本實驗目的是通過體外研究方法進行初步探究。在作用蛋白的確定上，本實驗基于課題組前期的轉錄組測序分析，在低濃度鹽脅迫條件下，purR與purL基因表達量顯著下調，并且已有研究也表明purR基因在微生物的許多生理活動中起調控作用，具有全局調控機制；purL基因與微生物的生理活動也有著密切關系，解淀粉芽孢桿菌purL基因突變株的細菌素合成量顯著升高，推測其對細菌素合成具有調控作用。基于以上原因，本研究先通過體外實驗研究purR與purL基因對植物乳桿菌細菌素合成的調控作用。

通過基因重組技術，體外成功合成了PurR和PurL蛋白，為其體外與啟動子的結合作用實驗提供支撐。在BLI實驗時，通常選擇對DNA進行biotin修飾，將生物素化的DNA固化在SA傳感器上，將蛋白作為分析物，但在實驗過程中發現帶有His標簽的PurR和PurL蛋白與SA傳感器具有非特異性結合，通過加入BSA與Tween 20無法消除存在的非特異性結合，所以不能選擇SA傳感器進行實驗。Ni-NTA傳感器能夠捕獲帶有His標簽的分子，所以嘗試將帶His標簽的蛋白固化在Ni-NTA傳感器上，將DNA作為分析物進行實驗，結果沒有觀察到PurR蛋白和PurL蛋白與植物乳桿菌KLDS1.0391細菌素合成啟動子直接的結合作用。BLI技術通過檢測生物傳感器底部膜厚度的變化，計算分子間的相互作用強度，將DNA作為分析物，結合在傳感器底部，并不能引起較大膜層厚度的改變，因此還需要通過其他實驗進一步驗證。進一步EMSA實驗，PurR和PurL蛋白與植物乳桿菌KLDS1.0391細菌素合成啟動子也無直接的結合作用，所以體外實驗表明，purR和purL基因可能并不直接參與細菌素合成的調控。有研究表明，乳酸乳球菌中的purR與枯草芽孢桿菌中的purR同源，后者是轉錄抑制蛋白，前者是轉錄激活蛋白[5]，在植物乳桿菌KLDS1.0391中，推測purR也起轉錄激活作用，purR表達量下調引起purL等基因的表達下調，purL基因的表達量降低會影響焦磷酸硫胺素（thiamine pyrophosphate，TPP）與肌苷一磷酸（inosine monophosphate，IMP）的合成，Liu Quanli等[15]研究表明，解淀粉芽孢桿菌中purL基因突變株的TPP與IMP合成均受到抑制，菌株抑菌能力增加，向底物中添加TPP后菌株抑菌能力恢復到與野生菌株相同水平。因此，在2% NaCl脅迫條件下，植物乳桿菌KLDS1.0391中purR和purL表達量降低，推測有可能對細菌素合成量升高起到間接的調控作用。但是蛋白調控過程是一個涉及到菌體內多種因素的復雜的網絡調控過程，菌體內環境復雜，菌體外研究所得到的結果不一定能真實反映菌體內的結合情況，還需進一步研究菌體內兩種蛋白是否具有結合能力以及兩種蛋白是否參與細菌素合成的調控。

4 結 論

體外成功構建重組蛋白PurR和PurL，EMSA實驗以及BLI技術結果表明，2 個重組蛋白與植物乳桿菌KLDS1.0391細菌素合成基因的啟動子在菌體外無直接結合作用，在菌體內的情況以及2 種蛋白對細菌素合成的調控是否屬于間接調控作用，需進一步研究。