牛肉低溫貯藏環境中沙門氏菌誘導耐酸響應的存在程度及其產生機制

郎晨曉，張一敏，朱立賢，梁榮蓉，毛衍偉，楊嘯吟，韓廣星，羅 欣,*，董鵬程,*

（1.山東農業大學食品科學與工程學院，山東 泰安 271018；2.國家肉牛牦牛產業技術體系臨沂站，山東 臨沂 276000）

沙門氏菌（Salmonella）能夠引起腹痛、腹瀉、腸胃炎和發燒等疾病，是世界范圍內造成人類感染和經濟損失的重要食源性致病菌[1]。據歐盟食品安全局統計，沙門氏菌在2017年引發93 583 例人類感染，并在2013—2017年間始終是引發歐盟食源性疾病的第二大食源性致病菌[2]。在我國，動物性食品的消費是引發沙門氏菌病的首要原因[3]。誘導耐酸響應（acid tolerance response，ATR）是指細菌在微酸條件下生存一段時間后（即誘導過程），對普遍致死的強酸性環境（即酸激介質）的抵抗能力增強的現象，又稱作酸耐受應答反應[4]。ATR一旦形成，不僅能提高細菌對酸的抵抗，還能增強菌株毒力基因的表達，增強細菌耐熱、耐鹽、耐氧化等能力，使細菌輕易越過食品加工過程中的各類柵欄因子，危害終端食品的安全[4-5]。針對肉類生產，冷鮮牛肉的生產及成熟過程具有誘發沙門氏菌ATR的可能，這些誘導因素包括酸性消毒減菌劑的廣泛應用在工廠內部形成的弱酸環境、宰后胴體pH值的降低、高蛋白的營養成分等[6-8]。然而目前沙門氏菌ATR被引發后，其在肉牛的屠宰過程及牛肉貯藏過程中的消長規律仍不明確，并且，外界的弱酸性環境誘發細菌的ATR相關反應機理仍需進一步探索。

細菌誘導耐酸現象的產生是多重生理生化作用的共同結果，如雙組分調控系統（two-component regulatory system，TCS）、酸休克蛋白（acid shock proteins，ASPs）、細胞膜脂肪酸組成的調節、膜系統對質子的阻擋及外排以及基于氨基酸代謝的細胞內pH值平衡的維持等過程[9]。其中，TCS對于酸性信號的感知至關重要[10]，它由一個跨膜的組氨酸蛋白激酶和一個位于胞質內的調控蛋白組成，是細菌感知外界環境信號，并將信號分子傳導至菌體內部，從而激發相應調控機制的重要結構[11]。多個研究表明，作為TCS體系中的一種，PhoP/PhoQ可以響應酸性信號，激活下游的ATR，產生小分子ASPs增強細菌的酸耐受能力[12-14]。然而，除ASPs外，PhoP/PhoQ與氨基酸代謝等機制的相互作用仍鮮見報道。氨基酸代謝能夠通過脫羧作用消耗質子并產生堿性物質，是細菌維持胞內pH值穩定的重要生化過程，沙門氏菌的精氨酸脫羧和賴氨酸脫羧系統也被廣泛報道[15-16]。Tran等[10]通過定量蛋白質組對沙門氏菌PhoP/PhoQ正常及缺失菌株進行對比，發現缺失組中與精氨酸代謝相關的約10 種蛋白質表達出現差異，說明沙門氏菌的精氨酸代謝與PhoP/PhoQ調控有關。鑒于精氨酸代謝是細菌ATR的重要機制[15]，推測除了ASPs途徑，氨基酸代謝可能也是PhoP/PhoQ調控的重要靶過程。與此同時，除PhoP/PhoQ外，雙組分系統有著多元化的信號感應體系，如PmrA/PmrB、EvgS/EvgA也能對H+作出響應[17-18]，有可能在調節氨基酸代謝方面存在協同或拮抗作用。

因此，本研究模擬沙門氏菌在牛肉生產、貯藏過程中經歷的弱酸、低溫、高蛋白的環境，輔以λRed基因敲除技術，探究微酸誘導、低溫長期貯藏、雙組分調控對沙門氏菌ATR的影響，以明確ATR在牛肉加工與貯藏過程中的存在程度與消長規律。并通過實時聚合酶鏈式反應（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）、氨基酸添加實驗等技術建立雙組分系統與氨基酸代謝的聯系，提出并驗證沙門氏菌的雙組分系統PhoP/PhoQ和PmrA/PmrB能夠感應細胞外H+濃度，并調控氨基酸代謝系統以獲得更高的耐酸性這一理論假設，旨在進一步解釋細菌誘導ATR產生的內在機理。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

鼠傷寒沙門氏菌標準菌株（S. typhimuriumATCC 14028）由山東農業大學食品科學與工程學院肉品實驗室保存。

腦心浸液（brain heart infusion，BHI）培養基、腦心浸液瓊脂（brain heart infusion agar，BHIA） 北京陸橋技術股份有限公司；MiniBEST Universal RNA提取試劑盒、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real time） 寶生物工程（大連）有限公司；L-精氨酸、L-賴氨酸 北京博奧拓達科技有限公司。

1.2 儀器與設備

5804R離心機、移液槍 德國Eppendorf公司；G154DWS滅菌鍋 致微（廈門）儀器有限公司；T100 PCR儀、CFX96實時PCR檢測系統 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 TCS缺陷菌株的構建

參照姜娜等[19]的方法，利用λRed重組系統，分別構建TCS PhoP/PhoQ缺失菌株ΔphoP和TCS PmrA/PmrB缺失菌株ΔpmrA。首先，利用PCR技術構建phoP和pmrA基因的同源打靶片段，片段的上下游為目的基因的同源臂，中間為卡那霉素抗性基因。同時，為制作感受態細胞，將質粒pKD46轉化至鼠傷寒沙門氏菌14028，并用L-阿拉伯糖誘導Red重組蛋白的表達。而后將PCR擴增的同源片段電轉化至宿主細胞，使打靶片段與菌體基因組發生同源重組，并同時獲得氨芐抗性，立刻孵育重組細胞，復蘇后用卡那霉素和氨芐青霉素抗性平板篩選突變子。最后將質粒pCP20轉化入鑒定成功的突變子，利用其表達的FLP翻轉酶去除重組菌的抗性，獲得ΔphoP和ΔpmrA菌株。

1.3.2 肉質培養基（meat medium，ME）的制備

參照álvarez-Ordó?ez等[20]的方法，將牛肉去除脂肪和筋腱后切碎，375 g牛肉與750 mL去離子水在燒杯中混勻后滅菌（121 ℃、15 min），然后用無菌紗布過濾出肉湯，分裝于100 mL離心管并置于-20 ℃備用。

1.3.3 低溫貯藏過程中沙門氏菌耐酸能力的測定

參照Buchanan等[21]的方法，利用添加葡萄糖的方式激發出細菌的ATR。TSBG培養基（添加10 g/100 mL葡萄糖的TSB培養基）的pH值在培養過程中緩慢下降，能夠為細菌提供溫和的酸性適應環境，達到酸誘導的目的。

將-20 ℃保存的正常沙門氏菌14028和ΔphoP（20 μL）接種于10 mL NTSB培養基（TSB去除葡萄糖）中37 ℃過夜活化，然后取100 μL培養物分別接種于50 mL NTSB（對照組）和50 mL TSBG（微酸誘導組），37 ℃過夜培養。將培養物10 000×g、4 ℃離心5 min得到的菌體轉移至（4±2）℃的100 mL ME中低溫貯藏7 d。貯藏過程中菌株耐酸能力的測定參照Liu Jiamei等[22]的方法，在第1天和第7天從ME中取出適量菌液，根據提前測定的培養基中的活菌濃度，通過蛋白胨緩沖液稀釋后接種于9 mL pH 3的BHI（用HCl溶液調節）中，統一細胞濃度為5（lg（CFU/mL）），37 ℃酸激2 h。在酸激前和酸激后，梯度稀釋并涂布于BHIA平板，37 ℃過夜培養后進行菌落計數。進行3 次獨立重復實驗。

參照Skandamis等[23]方法，用菌落下降數表示耐酸能力。菌落下降數是指菌株在酸激前與酸激后的菌落對數值的差（lg（CFU/mL））。菌落下降數值越大，代表菌株的耐酸能力越弱。

1.3.4 氨基酸代謝相關基因表達量的測定

將沙門氏菌14028、ΔphoP和ΔpmrA（20 μL）接種于10 mL NTSB中活化后，取20 μL培養物接種于10 mL的pH值為5.4的NTSB（牛肉的極限pH值為5.4[24]）中，37 ℃過夜誘導。

按照RNA提取試劑盒說明提取3 種菌的RNA，將符合濃度和純度的RNA反轉錄成cDNA，置于-20 ℃保存。按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser的說明進行real-time PCR，PCR體系包括2 μL cDNA、12.5 μL 2×SYBR PremixExTaq(Tli RNaseH Plus)、9.5 μL RNase Free Water和0.5 μL濃度為10 μmol/L的上下游引物。PCR程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，40 個循環；熔解曲線按儀器默認程序。

本實驗所用的基因為精氨酸代謝中編碼精氨酸脫羧酶的adiA、賴氨酸代謝中編碼賴氨酸脫羧酶的cadA以及內參基因rrsA，引物的堿基序列[25]見表1。

表 1 real-time PCR的引物序列Table 1 Primer sequences used for real-time PCR

參照Livak等[26]的2-??Ct方法進行基因相對表達分析，將組分系統正常的沙門氏菌的基因表達量作為對照，最終結果用2-??Ct表示。實驗進行3 次獨立重復。

1.3.5 添加氨基酸實驗的菌株ATR分析

參照Jonge等[27]的方法，取1 mL 1.3.4節過夜誘導后的3 種菌液（細胞濃度約為7.5（lg（CFU/mL））），分別接種于9 mL pH 2.5（用HCl調節）的純礦物質培養基（MM）、添加0.01 g/100 mLL-精氨酸的礦物質培養基（MM+Arg）、添加0.01 g/100 mLL-賴氨酸的礦物質培養基（MM+Lys）中，置于37 ℃酸激2 h。在酸激前和酸激后分別進行菌落計數，最終用菌落下降數表示菌株的耐酸能力。實驗進行3 次獨立重復。

1.4 數據分析

real-time PCR數據用Bio-Rad CFX Manager 3.1軟件處理。用SAS 9.0軟件的混合模型（MIXED Procedure）進行耐酸性分析，在低溫貯藏的耐酸性測定實驗中，雙組分系統、微酸誘導處理、貯藏時間及其交互作用作為影響耐酸性的固定因素，實驗重復作為隨機因素，在酸激介質中添加氨基酸的耐酸性測定實驗中，酸激介質、雙組分系統及其交互作用作為影響耐酸性的固定因素，實驗重復作為隨機因素，數據用平均值±標準誤表示，P＜0.05，差異顯著。用Sigmaplot 10.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 微酸誘導、雙組分基因敲除及長時間低溫貯藏對沙門氏菌耐酸性的影響

表2顯示經過不同誘導處理的PhoP/PhoQ正常菌（14028）和缺失菌（ΔphoP）在不同貯藏時間點的耐酸情況，菌落下降數越大細菌的耐酸能力越弱。雙組分系統、微酸誘導處理、低溫貯藏時間三因素的交互作用對耐酸能力影響不顯著（P＞0.05）。雙組分系統和微酸誘導處理、微酸誘導處理和低溫貯藏時間的交互作用對耐酸能力有顯著影響（P＜0.05）。

表 2 低溫貯藏（（4±2）℃）過程中不同誘導處理的菌株耐酸能力Table 2 Acid tolerance of strains with different induction treatments during storage at (4± 2) ℃

圖 1 低溫貯藏（（4±2） ℃）過程中沙門氏菌的耐酸能力Fig. 1 Acid tolerance of Salmonella during storage at (4 ± 2) ℃

圖1為沙門氏菌ATR的產生以及在低溫貯藏過程中的消長變化，及貯藏前微酸誘導處理和低溫貯藏時間的交互作用對沙門氏菌耐酸性的影響。經過TSBG微酸誘導菌株的耐酸能力顯著高于對照組（P＜0.05），說明沙門氏菌分解其中葡萄糖形成的微酸環境能夠激發細菌的ATR，與Malheiros[28]和Samelis[29]等的研究結果一致。誘導菌株在第7天的耐酸性仍顯著高于未誘導組（P＜0.05），這說明，沙門氏菌的ATR一旦產生，在低溫環境中至少可以維持7 d，該結果表明，致病菌的ATR可能會貫穿牛肉的整個分割、運輸和貯藏過程，并且其產生的耐酸、耐滲透壓、耐鹽等交叉保護作用可能隨原料一直進入下游產品（如發酵肉制品），突破柵欄因子，對食品安全造成極大的危害，但目前這種現象在牛肉產業的存在卻很少受到重視。

相對于微酸誘導組，對照組菌株在7 d低溫貯藏過程中的耐酸能力無顯著變化（P＞0.05），說明雖然在長期貯藏過程中沙門氏菌一直處于微酸的肉湯培養基中（pH值為5.2～5.7），但該低溫環境并未引發對照組菌株耐酸性的增強，其原因可能是沙門氏菌的誘導耐酸應激狀態的產生需要蛋白質從頭合成以及能量大量消耗[30]，而低溫的貯藏環境可能抑制了相關酶的活性，進而抑制了貯藏過程中ATR的產生。與之形成對比的是，誘導菌株在第7天的耐酸能力顯著高于第1天（P＜0.05），這可能是因為貯藏期之前的微酸誘導處理已經激發了細菌包含誘導耐酸在內的某些應激機制，產生酸休克蛋白，在貯藏過程中持續調節沙門氏菌生理過程，進而表現出逐步增強的耐酸性現象。類似地，Tiwari等[30]的研究表明貯藏前誘導的沙門氏菌從外界酸性信號感知到ATR相關蛋白的合成僅需要1 h，在1 h后添加四環素和氯霉素等抑制蛋白產生的抗生素對于誘導耐酸的抑制已經失去效果，同時，溫度因素對于ATR的影響極大，并且顯著高于培養基中營養成分對耐酸性的影響。

圖 2 不同菌株的耐酸能力Fig. 2 Acid tolerance of different strains

為研究雙組分系統PhoP/PhoQ對菌株誘導耐酸能力的貢獻，分析微酸誘導處理和敲除雙組分基因的交互作用對耐酸性的影響，如圖2所示。結果顯示，PhoP/PhoQ對耐酸性的提升與細菌貯藏前微酸誘導處理有顯著交互影響（P＜0.05）。phoP基因的敲除能夠顯著降低微酸誘導處理組沙門氏菌的耐酸能力（P＜0.05），但對對照組的影響并不顯著（P＞0.05）。該結果表明微酸誘導處理和雙組分系統能夠協同提升沙門氏菌的耐酸能力，是沙門氏菌ATR系統的兩個重要組成成分，并證實了微酸環境中的H+通過PhoP/PhoQ啟動沙門氏菌內部的耐酸機制Soncini等[17]研究結果表明PhoP/PhoQ能夠感應環境中的H+，當環境中的Mg2+濃度較高時，被PhoP/PhoQ激活的下游基因的表達反而出現下調，出現拮抗效應，但本實驗中PhoP/PhoQ調控ATR的過程是否受金屬離子影響仍待研究。

當phoP缺失后，經過誘導的沙門氏菌的耐酸能力雖然降低，但仍顯著高于未經誘導的菌株（P＜0.05），這說明在誘導菌株抵抗酸性脅迫的過程中，除PhoP/PhoQ，還有其他耐酸機制的保護作用，如其他雙組分信號感應體系、細胞膜系統和質子外排系統等。已有研究表明，細菌的PmrA/PmrB、OmpR/EnvZ等雙組分系統也能夠對外界的酸性信號作出響應[17,31]。

2.2 TCS缺失對精氨酸和賴氨酸代謝相關酶基因表達量的影響

氨基酸脫羧反應能夠消耗細胞內部的質子，配合細胞膜上的氨基酸轉運體系，維持細胞內部的pH值，減少外界酸性環境對細胞的損傷，提高細菌在酸性脅迫下的殘存率，其中，精氨酸脫羧系統和賴氨酸脫羧系統是重要的組成部分[15-16]。為研究PmrA/PmrB是否與PhoP/PhoQ相同，也能調控沙門氏菌ATR，并且該過程是否是通過精氨酸和賴氨酸兩種脫羧代謝途徑實現，本研究對比了PmrA/PmrB和PhoP/PhoQ缺失前后，沙門氏菌的兩種脫羧酶編碼基因（adiA和cadA）的表達水平。

圖 3 組分系統基因缺失后精氨酸脫羧酶編碼基因adiA相對表達量變化Fig. 3 Change in adiA (encoding arginine decarboxylase) expression under the deficiency of TCS-related genes

圖3結果顯示，沙門氏菌的phoP和pmrA缺失后，精氨酸脫羧酶編碼基因adiA相對表達量顯著降低（P＜0.05）。該結果表明，除PhoP/PhoQ，PmrA/PmrB也能被環境中的H+信號激活，進而對ATR產生調控，精氨酸脫羧系統是它們的正向調控靶系統。Brenneman等[32]發現當菌株的adiA和adiC（編碼逆向轉運蛋白）被誘導表達時，PhoP/PhoQ缺失沙門氏菌在pH 3.0的環境中存活能力顯著提升，間接證實了雙組分系統對氨基酸代謝的調控。Tran等[10]發現沙門氏菌的PhoP/PhoQ缺失后，與精氨酸代謝相關的10 種蛋白質表達出現差異，說明精氨酸代謝與PhoP/PhoQ有關，與本實驗的結果一致。

圖 4 組分系統基因缺失后賴氨酸脫羧酶編碼基因cadA相對表達量變化Fig. 4 Change in cadA (encoding lysine decarboxylase) expression under the deficiency of TCS-related genes

圖4結果顯示，與adiA結果類似，ΔphoP和ΔpmrA的賴氨酸脫羧酶編碼基因cadA相對表達量也顯著低于正常菌（P＜0.05）。說明除精氨酸脫羧通路外，賴氨酸脫羧系統也能夠受到PhoP/PhoQ和PmrA/PmrB的正向調控。值得注意的是，沙門氏菌的PhoP/PhoQ和PmrA/PmrB在應激調控過程中可能存在協同作用，如Kato[33]和Spector[5]等研究表明，當菌株的PhoP/PhoQ被環境中Mg2+信號激活后，能夠促進下游PmrD蛋白的表達，而PmrD又能夠進一步激活PmrA/PmrB，兩種TCS進而共同調控下游機制，如對脂多糖上脂質A進行修飾等。但本實驗中的兩種氨基酸代謝的調控過程中，PmrA/PmrB與PhoP/PhoQ是否存在聯系，仍需進一步研究與驗證。

2.3 酸激介質中添加精氨酸和氨基酸對菌株ATR的影響

為從表觀現象驗證PhoP/PhoQ和PmrA/PmrB能夠通過精氨酸代謝和賴氨酸代謝進一步調控沙門氏菌的誘導耐酸現象，通過在酸激介質中添加精氨酸和賴氨酸，對比PhoP/PhoQ和PmrA/PmrB正常與缺陷菌株的耐酸能力（表3），結果顯示雙組分系統、氨基酸添加的交互作用能顯著影響沙門氏菌的耐酸性（P＜0.05）。

表 3 不同酸激條件下菌株的耐酸能力Table 3 Acid tolerance of different strains under different acid challenge conditions

對于同一菌株，在作為酸激介質的純礦物質培養基MM中添加精氨酸和賴氨酸后，3 種雙組分系統處理（正常菌、ΔphoP、ΔpmrA）的耐酸性均顯著升高（P＜0.05），該結果說明精氨酸和賴氨酸代謝都是沙門氏菌提高自身耐酸性的重要途徑，同時，在MM中雙組分系統突變菌的耐酸性顯著低于正常菌（P＜0.05），說明除氨基酸代謝外，PhoP/PhoQ和PmrA/PmrB可能還調動了其他的耐酸機制幫助細菌應對酸性脅迫。álvarez-Ordó?ez等[25]發現向MM中添加精氨酸和賴氨酸能顯著提高正常沙門氏菌的耐酸能力，Park等[34]也發現賴氨酸的存在能使正常沙門氏菌在pH 3的環境中殘存率顯著上升，與本實驗結論一致。此外，MM+Arg組和MM+Lys組的耐酸能力差異不顯著（P＞0.05），即不同的氨基酸種類對耐酸性的提高并無顯著影響。但Liu Jiamei等[22]發現在酸激培養基中添加賴氨酸后沙門氏菌的存活能力高于添加精氨酸的實驗組，這種差異可能是不同血清型菌株（S. typhimurium與S. heidelberg）對氨基酸代謝能力的不同所致。

雖然MM+Arg和MM+Lys組中添加了精氨酸和賴氨酸，但phoP或pmrA基因敲除后菌株的耐酸性仍顯著低于正常組（P＜0.05），說明氨基酸雖然有助于細菌提高酸耐受能力，但并不能改變TCS缺失導致的耐酸缺陷，該結果從表觀水平上驗證了前述real-time PCR的結論，即PhoP/PhoQ和PmrA/PmrB能夠通過控制氨基酸代謝增強沙門氏菌的耐酸能力。該發現進一步解釋了前期學者們在富含營養的食物中的耐酸實驗結果：如álvarez-Ordó?ez等[20]將微酸誘導后的沙門氏菌接種在肉湯中，發現肉湯培養基能夠顯著延長沙門氏菌在pH 3鹽酸中的存活時間；Waterman等[8]將沙門氏菌涂抹于富含蛋白質的蛋清上也發現了類似的現象。此外，有學者將沙門氏菌中PhoP/PhoQ的反應調控蛋白PhoP結合磷酸基團的天冬氨酸位點作為藥物作用的目標，驗證了藥物控制細菌毒力的可行性[35]，這提示可以通過破壞PhoP/PhoQ和PmrA/PmrB的結構或阻斷其作用途徑減弱沙門氏菌的ATR，增強殺菌劑效果，減少其對食品安全的危害。

3 結 論

本研究表明微酸誘導過程能顯著增強沙門氏菌的耐酸能力（P＜0.05），并且菌株的ATR一旦形成，在牛肉低溫貯藏（4 ℃）過程中可以維持至少7 d，其產生的交叉保護作用可能會嚴重威脅以牛肉為原料的下游產品的安全性。隨著貯藏保鮮技術的發展，冷鮮牛肉的貨架期也逐步延長，沙門氏菌耐酸性的存續時間與不同包裝、貯藏方式下貨架期的關系仍待進一步確定。微酸性肉質介質（pH 5.2～5.7）的低溫貯藏環境不能引發沙門氏菌的耐酸反應，說明低溫處理可以作為抑制沙門氏菌誘導ATR的方法?；蚯贸桶被崽砑訉嶒灲沂玖松抽T氏菌的雙組分系統PhoP/PhoQ和PmrA/PmrB均參與了外界酸性環境的感知，并可以通過調節精氨酸和賴氨酸的代謝水平提高細菌的耐酸性，因食品中豐富的氨基酸含量，該推論進一步解釋了食品基質在強酸環境下能為沙門氏菌提供保護的內在機理。除PhoP/PhoQ和PmrA/PmrB外，是否有其他組分系統參與沙門氏菌ATR的調控，以及這些系統能否通過酸休克蛋白和氨基酸代謝外的其他機制影響ATR仍待研究。