膠原多肽對白酒中4 種醛類物質的反應機理

劉 嫻，黃張君，李 霞，廖學品，石 碧

（四川大學輕工科學與工程學院，皮革化學與工程教育部重點實驗室，四川 成都 610065）

中國白酒是以糧谷為原料，酒曲為糖化發酵劑，經過固態、半固態或糖化發酵而成的蒸餾酒[1]。決定白酒風格和特征的微量成分占2%，目前已有超過2 000 種微量成分被檢測出來，其中包括醛類、酯類、醇類、雜環類、萜烯類、芳香類、酮類、含氮化合物、酸類、硫類、縮醛類和內酯類[2]。

白酒發展的導向是健康與風味，2016年孫寶國團隊首次提出健康白酒可以通過“內尋外加，自然強化”實現[3]。隨著檢測技術的發展，白酒中多種健康成分已成功實現了分離鑒定[4-6]。江南大學已經從白酒中檢測出非揮發性脂肽類化合物地衣素和多肽，證實它們具有抗癌、抗病毒、溶纖、抑菌活性以及對白酒中揮發性成分具有選擇性抑制作用[7-10]。而膠原多肽由于具有抗氧化、能夠預防動脈硬化、抗衰老易吸收等作用，已被廣泛應用于食品和化妝品行業[11]。白酒體系中適量的醛類揮發性成分可協調白酒的香氣釋放，但醛類物質過量便會導致白酒入口粗糙、口感不佳甚至產生刺喉的感受[12]，其中，糠醛能夠賦予白酒異香，但濃度過大時會呈現嚴重的辣味甚至焦苦味[13]。因此，膠原多肽與白酒體系中醛類物質的作用機理研究將為健康白酒的發展提供理論依據。

本實驗以模擬白酒體系為研究對象，通過紫外光譜、熒光光譜以及三維熒光光譜研究了膠原多肽與白酒中糠醛、苯甲醛、乙醛、異戊醛的相互作用，并提出了它們之間的反應機制。然后通過頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜（headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）技術分析膠原多肽對濃香型白酒中醛類物質含量的影響，揭示膠原多肽對白酒中揮發性成分及醛類物質的影響規律。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

膠原多肽為實驗室自制，平均分子質量3 000 Da；糠醛、異戊醛、乙醛、苯甲醛、正辛酸甲酯（以上均為色譜級，≥99.0%） 上海阿拉丁試劑有限公司；無水乙醇（色譜純） 成都天潤化工有限公司；濃香型白酒四川某酒業；純水為實驗室自制超純水。

膠原多肽儲備液：將0.4 g膠原多肽加入200.0 mL 52%（V/V）乙醇溶液中，配制成質量濃度2.0 g/L的膠原多肽儲備液；醛類物質儲備液：將糠醛、苯甲醛、乙醛和異戊醛分別用52%乙醇溶液稀釋成2.0、2.0、10.0、10.0 g/L的儲備液，于4.0 ℃低溫貯藏備用。

1.2 儀器與設備

Lumina型熒光光度計、TSQ 9000 GC-MS/MS儀賽默飛世爾科技有限公司；UV-1800BPC紫外-可見分光光度計 上海美普達儀器有限公司；ZWY-2102C溫控回旋立式雙層振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；75 μm CAR/PDMS固相微萃取頭 美國色譜科公司；VF-WAX ms（30 m×0.25 mm，0.25 μm）毛細管色譜柱美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 紫外光譜分析

參考吳繼紅[9]的方法略有修改，將不同質量濃度的糠醛、苯甲醛、乙醛、異戊醛和固定質量濃度（10.0 mg/L）的膠原多肽于309 K反應1.0 h后，利用紫外-可見分光光度計對樣品進行測定，紫外光譜的掃描范圍為波長190～300 nm。

1.3.2 熒光光譜分析

參考饒震紅等[14]的方法略有修改，在若干支50 mL比色管中分別加入5.0 mL膠原多肽儲備液，將不同質量濃度的4 種醛類物質分別加入上述膠原多肽溶液中，配制得到一系列質量濃度梯度的混合溶液。將上述溶液充分混合并在3 種不同溫度（293、301 K和309 K）反應1.0 h并進行熒光光譜分析。其中，激發波長設置為276 nm，發射波長為280～450 nm，激發和發射的狹縫寬度均為5.0 nm。

1.3.3 熒光猝滅機制的確定

為了研究糠醛、苯甲醛、乙醛和異戊醛對膠原多肽的猝滅機制，分別在293、301、309 K反應1.0 h后，通過Stern-Volmer方程[15]計算猝滅常數Ksv：

式中：F0和F為未添加猝滅劑和添加猝滅劑時的熒光強度；Ksv為猝滅常數；[Q]為猝滅劑的濃度；Kq為雙分子猝滅過程速率常數；τ0為無猝滅劑時大分子的平均熒光壽命（10－8s）。

膠原多肽與醛類物質結合常數和結合位點數可以由雙對數方程[16]計算：

式中：F0和F為未添加猝滅劑和添加猝滅劑時的熒光強度；Ka為結合常數；[Q]為猝滅劑的濃度；n為結合位點數。

1.3.4 相互作用力的確定

由Van’t Hoff公式[17]可以計算出反應熵變ΔS和焓變ΔH：

由式（2）～（4）可計算出結合常數Ka及結合位點數n，以及相互結合的熱力學參數。

1.3.5 三維熒光光譜分析

分別取5.0 mL膠原多肽儲備液于50 mL比色管中，固定膠原多肽含量，分別加入糠醛、異戊醛、乙醛和苯甲醛儲備液，配制得到醛類物質的濃度分別為0.026 0、0.188 5 mmol/L和36.322 4 mmol/L，然后于309 K反應1.0 h后取適量的溶液于1.0 cm的石英比色皿內，在激發波長260～380 nm（增量為1.0 nm）、發射波長230～320 nm（增量5.0 nm）的條件下進行三維熒光分析，得到三維熒光光譜。

1.3.6 HS-SPME-GC-MS分析

將一定含量的膠原多肽加入250 mL濃香型白酒中，配制得到膠原多肽質量濃度分別為0.0、2.0、20.0、200.0 mg/L，25 ℃放置12 h后分析白酒成分。

HS-SPME條件：根據文獻[9]，將酒樣酒度稀釋成10%，取8 mL稀釋后的酒樣于20 mL頂空瓶中，每個樣品瓶加入10 μL內標（正辛酸甲酯，最終質量濃度為0.093 8 mg/L），將樣品瓶在35 ℃平衡10 min，并在35 ℃萃取45 min，攪拌速率500 r/min，每個樣品重復萃取3 次。

GC條件：進樣口溫度270 ℃，載氣為He，分流比為20∶1，升溫程序：初始溫度40 ℃，保持5 min，以4 ℃/min的速率升至100 ℃，再以6 ℃/min的速率升至230 ℃，保持10 min。

MS條件：采用電子電離源，電離能量為70 eV；離子源溫度300 ℃；掃描范圍m/z35～400；溶劑延遲時間3.50 min。

1.4 數據分析

所有實驗重復3 次，采用Microsoft Office Excel 2010對實驗所得數據進行處理及Origin 2018軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 紫外光譜分析

紫外-可見吸收光譜能夠簡單、快速、有效地測定復合物的形成。當小分子化合物與蛋白質發生相互作用時，其紫外光譜圖中吸收峰會產生明顯變化[18]。本研究中，膠原多肽在波長198 nm處存在最大吸收峰，其與膠原多肽鏈上—C＝O的n—π*躍遷有關[14]。

圖 1 膠原多肽與不同濃度糠醛（a）、苯甲醛（b）、乙醛（c、d）和異戊醛（e、f）的紫外光譜圖Fig. 1 UV absorption spectra of collagen peptide in the presence of different concentrations of furfural (a), benzaldehyde (b), acetaldehyde (c, d),and isovaleraldehyde (e, f)

如圖1a、b所示，隨著糠醛和苯甲醛濃度的逐漸升高，混合溶液在198 nm波長處的吸收峰均呈現增強現象。在糠醛-膠原多肽體系中，糠醛在224 nm波長處的峰隨著糠醛濃度的增加產生紅移現象；而在苯甲醛-膠原多肽體系中，苯甲醛濃度的升高使膠原多肽在198 nm波長處的吸收峰有明顯紅移的現象。上述結果表明，糠醛和苯甲醛這兩種醛類物質能與膠原多肽產生相互作用[19]。在圖1c、e中，當乙醛和異戊醛濃度較低時，紫外吸收峰未產生明顯變化，說明低濃度的乙醛和異戊醛與膠原多肽未發生相互作用。繼續增加乙醛和異戊醛濃度，如圖1d、f所示，膠原多肽在198 nm波長處的吸收峰強度逐漸增大，并且乙醛-膠原多肽體系在280 nm波長左右和異戊醛-膠原多肽體系在290 nm波長左右出現一個新的吸收峰，且該吸收峰的強度也隨著乙醛和異戊醛濃度的增加呈明顯增強趨勢，說明當乙醛和異戊醛的濃度較高時，能與膠原多肽發生反應并形成復合物。可能是膠原多肽的氨基與醛基反應生成—C＝N—席夫堿結構，其反應機理如圖2所示，通常生成席夫堿的反應是一個可逆反應，穩定性差，但由于芳香族醛具有一定的疏水性，能夠與膠原多肽以疏水鍵結合，因此芳香族席夫堿比脂肪族席夫堿更穩定[20]。因此，糠醛與苯甲醛更容易與膠原多肽發生反應，而乙醛和異戊醛只有濃度較高時，才能與膠原多肽形成復合物，從而在紫外光譜中表現出明顯的差異。白酒中乙醛濃度僅在3.405 2～6.810 4 mmol/L之間，異戊醛濃度范圍鮮有報道，但應該遠少于白酒中乙醛的濃度[13]，所以在白酒中加入的膠原多肽基本上不會與乙醛和異戊醛進行反應。

圖 2 醛-膠原多肽反應機理Fig. 2 Reaction mechanism between aldehydes and collagen peptide

普遍認為糠醛是白酒中的苦味物質之一[21]，本研究表明白酒中加入膠原多肽可與糠醛結合，從而降低白酒的苦味。另一方面，膠原多肽中含有多種對人體有益的活性肽[22]。因此，在白酒中加入膠原多肽不僅可以減少苦味，還具有一定的保健功能。

2.2 熒光光譜分析

2.2.1 熒光猝滅光譜

熒光光譜能夠反應小分子化合物和蛋白質之間結合環境的變化，因此被廣泛應用于蛋白質與小分子之間相互作用的研究[23]。膠原多肽中主要由酪氨酸殘基產生熒光。由圖3可知，隨著糠醛、苯甲醛、乙醛和異戊醛4 種醛類物質濃度的增加，膠原多肽的熒光產生明顯的猝滅現象，但未出現紅移或藍移。

圖 3 膠原多肽與不同濃度醛類的熒光光譜Fig. 3 Fluorescence spectra of collagen peptide with different concentrations of aldehyde

熒光猝滅分為靜態猝滅、動態猝滅及動態靜態結合猝滅。這些猝滅機制可以通過猝滅常數隨溫度變化和熒光壽命的變化進行區分。動態猝滅是猝滅劑分子與熒光分子的激發態分子之間產生相互碰撞而導致的熒光猝滅，溫度越高，猝滅常數越大，故猝滅常數與溫度變化呈正比。靜態猝滅是猝滅劑分子與熒光分子在基態時生成不發熒光的復合物，其中，猝滅常數隨著溫度的升高而降低。動態靜態結合猝滅是由于同一熒光基團受到碰撞和形成復合物而導致的，可以根據猝滅劑濃度的大小和變化趨勢進行判斷[24-25]。

表 1 膠原多肽分別與糠醛、苯甲醛、乙醛和異戊醛相互作用的Stern-Volmer常數Table 1 Stern-Volmer constants for the interactions of collagen peptide with furfural, benzaldehyde, acetaldehyde and isovaleraldehyde

由表1可知，當猝滅劑為糠醛和苯甲醛時，猝滅常數隨著溫度增高而降低，且Kq均遠大于2×1010L/（mol·s），說明發生的是靜態猝滅，膠原多肽與糠醛和苯甲醛生成了復合物[26]。當猝滅劑為異戊醛和乙醛時，猝滅常數隨著溫度升高而升高，且Kq均小于2×1010L/（mol·s），說明在此濃度范圍內發生動態猝滅，乙醛和異戊醛與膠原多肽未形成復合物[27]。

2.2.2 相互結合的作用力分析

通過熒光實驗結果分析可知，當猝滅劑為糠醛和苯甲醛時，膠原多肽與其結合形成了復合物。因此，本研究通過熱力學計算對它們之間的結合作用力進一步分析。由圖4可見，雙對數方程擬合結果具有良好的線性關系，可由此得到結合常數Ka及結合位點數n。由表2可見，不同溫度下苯甲醛與膠原多肽以及糠醛與膠原多肽的結合位點數約為1[17]。

大分子化合物和小分子化合物的結合力主要有4 種，分別為氫鍵、范德華力、疏水作用力、靜電作用力。根據熱力學規律可知，當ΔS＜0和ΔH＜0時，主要是氫鍵和范德華力；當ΔS＜0和ΔH＞0時，主要為靜電作用力；當ΔS＞0和ΔH＞0時，主要為疏水作用力[28]。由表2可見，糠醛-膠原多肽體系和苯甲醛-膠原多肽體系的ΔG＜0，且隨著溫度的升高而降低，說明糠醛和苯甲醛與膠原多肽的反應都是自發進行的。熵變與焓變均大于0，說明它們之間主要以疏水作用力相結合[29]，這與紫外光譜的分析結果一致。

圖 4 糠醛與膠原多肽混合體系（a）、苯甲醛與膠原多肽混合體系（b）在不同溫度下的雙對數方程Fig. 4 Double logarithmic plots for furfural-collagen peptide (a) and benzaldehyde-collagen peptide (b) at various temperatures

表 2 膠原多肽與糠醛和苯甲醛結合形成分子復合物的結合常數、結合位點數和熱力學參數Table 2 Binding constants, number of binding sites and thermodynamic parameters of molecular complexes formed by the interactions of collagen peptide with furfural and benzaldehyde

2.3 三維熒光光譜

三維熒光可以更為直觀地描述被測物質的熒光變化信息[30]。圖5為膠原多肽中加入低（0.026 0 mmol/L）、中（0.188 5 mmol/L）和高（36.322 4 mmol/L）3 個濃度的糠醛、苯甲醛、乙醛和異戊醛前后的熒光變化等高線譜圖，圖中A（λem＝λex）代表瑞利散射峰，Peak 1代表膠原多肽中酪氨酸殘基特征熒光峰[31]。比較圖5a～d，隨著醛的加入Peak 1的熒光強度均有減弱的現象，說明它們之間能夠發生相互作用。當糠醛濃度僅為0.026 0 mmol/L時，即可看到明顯的熒光猝滅；當苯甲醛濃度為0.188 5 mmol/L時，能看到明顯的熒光猝滅；當乙醛和異戊醛濃度高達36.322 4 mmol/L才可看到明顯的熒光猝滅。因此，這4 種醛類物質對膠原多肽相互作用強弱順序為：糠醛＞苯甲醛＞異戊醛＞乙醛。三維熒光的分析結果進一步證明，膠原多肽能夠與糠醛和苯甲醛發生明顯的相互作用，而乙醛和異戊醛只有在高濃度下才可能與膠原多肽發生相互作用。

圖 5 膠原多肽-醛溶液體系的三維熒光光譜Fig. 5 Three-dimensional fluorescence contour spectra of collagen peptide-aldehydes

2.4 膠原多肽影響白酒中揮發性成分的HS-SPME-GCMS分析結果

本研究目的主要是考慮健康酒即配制酒。模擬體系組成單一，能夠準確的闡明反應過程；而真實白酒體系太過復雜，干擾因素太多，難于準確揭示膠原多肽與醛的反應機理，而發酵白酒中這幾種醛是存在的，只是不同的發酵條件下含量不同而已[1]。因此，本實驗在模擬體系的基礎上，將不同含量的膠原多肽加入濃香型白酒中，采用HS-SPME-GC-MS分析技術定性和內標法定量，用真實體系驗證上述模擬體系所得出的結果。

對實際的白酒體系，采用HS-SPME-GC-MS分析共定性出30 種揮發性物質，其中22 種酯類化合物、3 種醛類化合物、1 種醇類化合物、2 種烷烴類、1 種酸類和1 種酚類化合物。加入膠原多肽后，白酒中揮發性成分含量均有不同程度的降低。其中醛類化合物含量降低較為明顯，當加入的膠原多肽質量濃度為200.0 mg/L時，3-糠醛的質量濃度從0.179 9 mg/L降低至0.144 6 mg/L，苯甲醛的質量濃度從0.506 8 mg/L降低至0.350 4 mg/L，這表明膠原多肽能夠與醛類物質發生相互作用。

3 結 論

本實驗通過建立模擬白酒體系，利用紫外光譜、熒光光譜和三維熒光光譜研究膠原多肽對糠醛、苯甲醛、乙醛和異戊醛的相互作用，并使用HS-SPME-GC-MS技術分析膠原多肽對實際的清香型白酒揮發性成分的影響。研究發現，膠原多肽與糠醛和苯甲醛之間以疏水作用力形成復合物，且溫度越高，疏水鍵作用越強；膠原多肽與低濃度的乙醛和異戊醛作用力較弱，但在高濃度下可觀察到明顯的相互作用；膠原多肽能夠顯著降低實際白酒中醛類物質含量。上述研究將為健康白酒以及配制酒的發展提供理論依據。