氧化應激、炎癥和免疫失衡三方聯動效應與奶牛常見健康問題的聯系及使用植物提取物進行干預的研究進展

李 欣 童津津 趙佳楨 蔣林樹

(北京農學院動物科學技術學院，奶牛營養學北京市重點實驗室，北京 102206)

近年來，植物提取物作為一種含有多種活性成分(如酚、醚、萜、酮、酸等)的物質，具有綠色、安全和無公害等優勢，是飼料添加劑的新選擇[6]，特別是在改善奶牛機體免疫狀態、提高飼料轉化率和抗氧化能力等方面具有顯著成效[6-7]。因此，本文圍繞奶牛在氧化應激、炎癥和免疫失衡三個方面的聯動效應及植物提取物在調控奶牛代謝性疾病方面的應用潛力進行綜述。

1 三方聯動效應及其與奶牛常見健康問題的聯系

1.1 氧化應激與抗氧化防御系統

正常情況下，機體在進行生理活動的時候不斷產生自由基，有相應的抗氧化防御系統對其進行清除，從而使機體保持動態平衡。過多的自由基致使抗氧化酶的產生減少，同時內源性抗氧化物水平也下降，使自由基產生與清除的動態平衡失常，發生內源性氧化應激，導致自由基重要分子損傷且修復損傷的能力也下降，影響自由基的正常生理功能[8]，誘導氧化應激的發生。ROS在一定水平內具有促進細胞正常功能的作用，一旦超過了機體抗氧化系統消除ROS的能力，會對細胞和組織造成功能障礙并產生實質性的傷害，從而啟動抗氧化防御系統[7,9]。研究發現，機體內的初級抗氧化防御系統有由超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等體內內源的抗氧化酶所組成的酶類抗氧化系統和維生素E、維生素C和β-胡蘿卜素等所組成的非酶類抗氧化防御系統[9]。而且據報道，構成抗氧化防御系統的材料為抗氧化劑，其既可以從飼糧中獲得也可以由機體自身合成，并暫時儲存在細胞中，如維生素E就是存在于細胞膜中的主要抗氧化劑，其具有破壞細胞膜之間相關脂肪酸自動氧化的自由基鏈式反應的作用[10]。

除此之外，氧化應激的發生還導致氧化還原敏感信號轉導途徑的激活，例如NF-κB途徑、NLRP3炎性途徑和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)-Nrf2-抗氧化劑反應原件(ARE)通路等，又誘導了各種促炎基因如白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等的表達[11]。據報道，圍產期奶牛產生氧化應激主要通過降低Nrf2的核移位和轉錄增強乳腺上皮細胞的氧化損傷，破壞蛋白質、脂質和DNA結構，致使乳腺上皮細胞凋亡，最終導致機體氧化還原不平衡[12]。MAPK-Nrf2-ARE通路是動物機體調節自身氧化還原狀態和應對外來刺激的一條重要的防御通路。正常情況下，在細胞內，Nrf2被其抑制蛋白[Kelch樣ECH關聯蛋白1(Keap1)]保持在胞漿中的基礎穩態水平，受到應激源刺激時，Nrf2從Keap1上解離出來，轉移到細胞核中與其下游抗氧化靶基因上游啟動子區的ARE結合，啟動SOD1、CAT、醌氧化還原酶1(NQO1)和過氧化物氧化還原酶1(PRDX1)，促進對過量ROS的清除[4]。因此，調節氧化應激和抗氧化防御系統的平衡對保持奶牛機體穩定具有重要意義。

1.2 氧化應激與炎癥反應

奶牛發生氧化應激后，多余的ROS會導致一系列的炎癥反應[13]，在炎癥中細菌和病毒等會破壞機體內的自由基穩態，進一步促進ROS的產生，參與病原體的復制、基因突變以及誘發宿主細胞凋亡，促使機體炎癥反應的加劇[8]，使奶牛機體對疾病的易感性增加，易患子宮內膜炎、乳腺炎[14-15]、蹄葉炎和酮病等[14-15]。炎癥期間白細胞也會產生ROS，形成正反饋回路，從而進一步加劇圍產期的氧化應激[16]，造成嚴重的惡性循環。研究發現，奶牛產生炎癥反應主要是氧化應激會導致多個信號分子的激活，主要有MAPK[17]、蛋白激酶B(PKB)[18]和NF-κB[19]等信號通路。據報道，MAPK和PKB信號通路的細胞外信號調節激酶1/2(ERK1/2)和p38MAPK因子被過量ROS激活，誘導細胞凋亡[15]；另外，ROS活化ERK信號通路后啟動Nalp-3炎性復合體的組裝和活化引起炎癥反應，Nalp-3炎性復合體是胞內模式識別受體[20]；其會促進IL-1β和白細胞介素-18(IL-18)的成熟，導致炎癥反應的發生[21]。除此之外，MAPK還可以通過增強TNF-α的表達，誘導細胞凋亡產生炎癥反應[22]。環氧合酶-2(COX-2)在奶牛發生炎癥反應包括乳腺炎時表達增強，可通過NF-κB信號通路導致機體內炎癥的發生[22-23]。

NF-κB是一種幾乎所有細胞都含有的轉錄因子，在細胞正常狀態下，NF-κB與它的抑制蛋白(inhibitory NF-κB,IκB)在胞質內組成無活性的復合物，當氧化應激發生時，IκB發生磷酸化并與NF-κB解離，NF-κB活化并進入細胞核與靶基因結合調控轉錄的發生，促使炎性因子的產生，從而啟動炎癥反應[24]。同時在氧化應激狀態下，線粒體持續生成的ROS還可通過激活NF-κB進一步激活Nalp-3炎性復合體誘導炎癥的發生[25]。氧化應激誘發炎癥發生時，炎癥反應誘導細胞內炎癥信號分子之一過氧化物氧化還原酶2(PRDX2)的產生與釋放，PRDX2釋放后作為炎癥介質激活細胞內TNF-α的產生與釋放，又加重炎癥的發生程度[26]。一方面，PRDX2被釋放后可作為氧化還原依賴性炎癥介質激活巨噬細胞產生和釋放TNF-α，從而加重炎癥反應程度；另一方面，PRDX2也是炎癥級聯反應的一部分，可以直接誘導TNF-α的釋放，加重炎癥反應程度[9]。

1.3 氧化應激與免疫調節

動物機體內的免疫系統是機體對于外部侵害，保護機體免受損傷的重要防御屏障。免疫平衡是指各種免疫細胞，如巨噬細胞、嗜中性粒細胞和天然殺傷細胞以及補體因子和特定的T淋巴細胞各自及相互作用的正負效應的調節，使免疫系統的激活和抑制保持平衡狀態[27]。免疫平衡是免疫系統保持穩定的根本保障，一旦免疫激活和抑制失去平衡就會產生免疫應激，導致動物機體健康受到挑戰。氧化應激產生的ROS引起炎癥反應時，免疫細胞表面的模式識別受體-Toll樣受體(TLRs)被啟動，其不僅可以識別病原相關分子模式，同時可識別因氧化應激出現的損傷相關分子模式并誘導巨噬細胞的活化，啟動免疫反應[28]。研究發現，奶牛的應激主要以過度的脂質動員、炎癥和氧化應激為特征，而氧化應激的發生與免疫功能受損息息相關[29]。因此，奶牛機體免疫細胞對氧化應激機制十分敏感，當免疫細胞受到刺激時產生的大量ROS無法及時清除則損害細胞功能，就會降低奶牛的免疫力[30]。簡而言之，ROS可通過TLRs和Nalp-3炎性復合體激活免疫系統，加速炎癥發生或免疫反應[20,28]；而炎癥反應會加速ROS的產生加劇氧化應激的程度，大量的ROS會引起免疫細胞的氧化損傷，進一步降低機體的免疫能力。有研究表明，當降低奶牛Nrf2下游抗氧化基因HO-1、SOD-1和CAT表達的同時也顯著降低IL-1β和TNF-α的表達水平[31]，這說明可通過上調Nrf2和下游抗氧化劑的表達控制炎癥發生防止免疫功能受損。番茄紅素作為一種強抗氧化劑作用于機體時，其主要是通過失活NF-κB信號通路和半胱天冬酶(caspase)/凋亡相關基因(Bax)凋亡通路降低促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達以及細胞凋亡率，而降低細胞炎性損傷，維持細胞內免疫平衡[32]。NF-κB與Nrf2-ARE信號通路之間相互關聯，前者是連接免疫系統和抗氧化的重要紐帶，后者能夠抵抗氧化損傷，保護機體不受外源性刺激，二者協同調節氧化應激—炎癥反應—免疫失衡鏈系統的整體聯動反應[27]。因此，本文基于三方聯動的機制，提出了營養干預管理技術，即通過添加植物提取物預防自由基失衡導致的多種奶牛營養代謝疾病。

1.4 三方聯動與奶牛常見疾病的聯系

自由基失衡導致氧化應激進一步影響機體免疫功能失衡[33]，激活炎癥信號通路，增加促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達，導致奶牛產生炎癥反應和疾病，最終導致奶牛免疫功能下降，引發奶牛乳房炎[32]、NEB[34]、糖脂代謝異常[35]及急性瘤胃酸中毒(SARA)[36]等疾病的發生。NEB發生時，奶牛體內非酯化脂肪酸(NEFA)含量升高以滿足產奶的能量需求[37]。在奶牛代謝需求增加的時期，脂肪酸是重要的能量來源，然而NEFA含量的升高被認為與氧化應激的發生、炎癥的出現以及擾亂機體免疫調節等密切相關。研究發現，高NEFA血癥會導致奶牛乳腺上皮細胞(BMECs)產生大量的ROS，過量的ROS導致氧化應激，致使BMECs發生氧化損傷。作為維持奶牛泌乳的基本功能單位，BMECs氧化損傷會造成乳腺功能受損，產奶量顯著降低，嚴重影響奶業健康發展。據報道，奶牛發生NEB時，體內過量的NEFA和β-羥丁酸(BHBA)可降低抗氧化酶的活性，導致自由基清除能力降低，血清中GSH-Px和CAT活性降低，但血清中ROS、MDA和H2O2的含量顯著升高，這些變化則導致了機體抗氧化系統被破壞，從而發生一系列的氧化應激損傷[12,38]。有研究發現，在奶牛患有胰島素依賴性糖尿病的情況下，其天冬氨酸氨基轉移酶(AST)和γ谷氨酰轉移酶(GGT)活性升高，受糖脂代謝異常的影響，SOD和CAT活性顯著降低，但GSH-Px活性無顯著變化[39]。這提示我們當奶牛糖脂代謝異常引發疾病時伴隨氧化應激的發生。當SARA發生時，可破壞奶牛體內的營養物質利用效率，損害胃腸道微生物群的功能，降低胃腸道上皮的吸收和屏障能力，引發炎癥反應。Zhang等[40]研究發現，圍產期飼喂高精料飼糧，可導致奶牛瘤胃上皮細胞中IL-1β、IL-6和IL-2等促炎因子的表達量顯著升高。除此之外，SARA導致瘤胃內產生大量內毒素(LPS)，LPS具有刺激血管收縮，降低血流量和血氧含量的作用，通過后腸道進入機體后引起炎癥反應，會導致蹄部缺血，誘導蹄葉炎的發生[36]等。同時血液中的LPS還會隨循環系統運輸至肝臟，但肝臟清除能力有限，進而LPS刺激肝臟產生大量急性期蛋白(APP)、包括血清淀粉樣蛋白(SAA)、結合珠蛋白(Hp)和LPS結合蛋白(LPB)等[41]。值得注意的是，當酮病發生時，奶牛在乳腺中發生NF-κB信號通路的傳導，NLRP3炎癥小體和抗凋亡因子-2(Bcl-2)/半胱天冬酶 -9(caspase-9)細胞凋亡途徑被激活，TNF-α，IL-6和IL-1β等炎性因子的表達顯著增加，進而激活乳腺炎癥反應和凋亡途徑[11]，使乳腺的防御能力下降。此外，有研究發現，亞臨床酮病可以導致奶牛外周血中性粒細胞吞噬能力和趨化能力的降低，由于產前和產后血液中NEFA和BHBA含量升高，導致白細胞趨化能力和吞噬能力降低，可以進一步引起乳腺對乳房炎病原體的敏感性升高，導致奶牛對乳腺炎易感率升高[42]。

2 植物提取物調節奶牛常見疾病的研究進展

2.1 NEB和酮病

目前，通過補充植物提取物可以糾正NEB來減輕氧化應激引起的炎癥反應和免疫失調已被廣泛報道。添加植物提取物后可提高總抗氧化能力(T-AOC)和增強GSH-Px活性來改善抗氧化劑狀態，抵消NEB的負面影響[43]。韓瑞陽[44]研究發現，山楂可通過降低甘油三酯、膽固醇、低密度脂蛋白含量及升高高密度脂蛋白含量，來調節脂代謝紊亂，有緩解奶牛發生NEB的潛力；此外，奶牛由于NEB引發的脂肪動員會損傷肝臟功能，堿性磷酸酶和GGT活性可反映肝臟的功能狀態，當組織細胞受損時會導致它們的活性升高[39]。劉國林等[45]研究發現，在奶牛飼糧中添加山楂和黃芪，奶牛血漿中的堿性磷酸酶、GGT活性和NEFA含量降低，說明添加山楂和黃芪可保護奶牛的肝臟功能并且緩解產后奶牛的NEB。由此可見，在奶牛飼糧中添加植物提取物可有效防治由于NEB產生的炎癥反應和免疫功能紊亂。酮病是奶牛產犢后發生NEB后導致的一種營養代謝性疾病，當發生NEB后血液中NEFA含量升高，NEFA隨血液轉運至肝臟進行氧化代謝，部分NEFA可被完全氧化為CO2和H2O進行供能，但因肝臟代謝功能有限，部分NEFA無法完全氧化生成BHBA和丙酮等酮體，肝臟中NEFA越多也就導致BHBA等酮體含量過高，最終引發不同程度的酮病[46]。近年來，植物提取物在奶牛預防或治療酮病的發生與發展也得到了廣泛研究。胡俊菁[47]通過給泌乳早期奶牛飼糧添加葡萄籽原花青素后測定奶牛抗氧化狀況和酮病等指標發現，添加葡萄籽原花青素(GSPE)可提髙泌乳早期奶牛血漿中葡萄糖含量，同時還提高乳汁中GSH-Px的活性，表明GSPE可及時調控奶牛機體抗氧化能力預防酮病的發生。宿孝奇[48]在添加原花青素對泌乳早期奶牛酮病、氧化應激研究中也發現，添加原花青素的試驗組與未添加的對照組相比，血漿CAT活性、丙二醛(MDA)、一氧化氮及酮體含量極顯著下降，添加初始NEFA含量也顯著下降，由此說明添加原花青素可有效提高奶牛機體抗氧化能力，降低血漿氧化代謝產物和酮體水平。還有研究表明，飼糧中添加茶、菊苣、龍膽草、香茅和甘草等植物的提取物使得圍產期奶牛體內的丙酮、NEFA和BHBA含量從第7天開始下降，第14天開始明顯降低，谷氨酸脫氫酶活性顯著增高，說明這些植物提取物對改善奶牛的酮病均有較好的效果[49]。在奶牛圍產期階段，誘導肝臟內質網應激有關的炎癥會促進脂肪肝綜合征和酮病的發生，但對奶牛補充由綠茶(95%)和富含多酚的姜黃提取物(5%)組成的植物產品，可以減輕肝臟的炎癥和內質網應激，并在產后1～3周奶牛肝臟中的甘油三酯和膽固醇含量較低，提示植物多酚的補充可能對提高奶牛的酮病和預防脂肪肝綜合征有作用[50]。產后奶牛體脂動員產生了大量NEFA，進而導致酮體含量升高，而添加山楂和黃芪可降低產后酮體含量[45]。綜上所述，為避免奶牛NEB和酮病的發生，可以采用在圍產期奶牛飼糧中添加植物提取物的方式幫助改善奶牛的健康狀況，改善牧場的盈利能力。

2.2 糖、脂代謝

奶牛由于營養代謝發生改變所以促使代謝作用發生協調變化，以滿足對葡萄糖、氨基酸和脂肪酸等物質的需求。奶牛發生葡萄糖缺乏時會引起脂肪動員，導致血液中脂肪酸含量增加，但高含量脂肪酸會干擾胰島素的信號傳導降低敏感性，發生胰島素抵抗[51]。機體發生胰島素抵抗又會加劇體脂動員的發生使脂肪酸含量增加，從而在奶牛體內發生惡性循環[52]，最終引起奶牛營養代謝疾病的發生如脂肪肝等。大量的研究結果表明，植物提取物在改善奶牛糖、脂代謝過程中具有重要作用。Stoldt等[53]研究發現，從產犢前3周開始持續6周，十二指腸瘺管奶牛每天服用0.9%的氯化鈉溶液溶解的100 mg/kg槲皮素二水合物，結果表明，槲皮素可抑制血清中AST和谷氨酸脫氫酶的活性，因谷氨酸脫氫酶的活性升高，指示肝細胞死亡或亞致死性損傷[54]，由此可見，槲皮素可保護肝臟免受損傷。此外，研究發現單寧可以與自由基組合以形成共振穩定的苯氧基自由基[55]，具有較高的清除活性氧自由基的能力。Liu等[56]在圍產期奶牛飼糧中添加板栗單寧，結果發現顯著降低了脂質過氧化產物之一——MDA的含量，并增加奶牛血漿和肝臟中抗氧化酶活性，改善了圍產期奶牛的抗氧化狀態和降低肝臟疾病的發生率。此外，據報道人參皂苷Rb1作為一種很有前途的天然降血糖藥物，通過清除自由基，抑制蛋白質非酶糖基化可有效調控體內的糖代謝[57]。有研究表明，菠菜衍生物可淬滅ROS降低氧化損傷，抑制NF-κB的激活，同時有可能改善代謝綜合征的組成部分，使菠菜成分通過誘導飽腹性激素、胰島素增敏活性以及與脂肪和碳水化合物消化酶之間發生相互作用進而發揮調節機體代謝作用[58]。Gessner等[59]發現，飼喂富含黃酮類化合物的植物提取物葡萄籽和葡萄渣粉提取物(GSGME)可減輕奶牛肝臟的炎癥和內質網應激。在奶牛飼糧中添加石榴籽漿(PSP)，在產前和產后均提高了血漿中T-AOC，降低了甘油三酯、游離脂肪酸(FFA)和BHBA含量，說明PSP可以改善抗氧化狀態，與脂質氧化(FFA和BHBA)的下降以及葡萄糖利用的增強有關[60]。所以，富含抗氧化劑的植物提取物可改善糖、脂代謝異常產生的肝臟疾病等且可應對由于氧化應激而產生的過量自由基，平衡圍產期奶牛的營養調控。

2.3 SARA

在奶牛分娩后，由于高能量需求，高產奶牛接受高精料的飲食，導致奶牛采食精料后在瘤胃發酵產生大量揮發性脂肪酸(VFA)，瘤胃pH降低，引起奶牛SARA的發生[61]。據報道，單寧可有效地抑制瘤胃中微生物的生長，尤其是對瘤胃蛋白降解菌的作用最為明顯，其可與細菌的細胞壁和細胞膜形成復合物導致細菌的細胞壁被破壞，以此達到抑制細菌生長的效果[62]，說明植物提取物單寧對于保持瘤胃健康有積極作用。Balcells等[63]研究發現，給小母牛飼喂植物類黃酮提取物可改善瘤胃發酵并減少SARA的發生率，這種作用可通過瘤胃中消耗乳酸的微生物——埃爾斯登氏瘧原蟲數量的增加來解釋。Humer等[64]發現，在奶牛的高精料飼糧中加入主要來源于薄荷和百里香的植物提取物，可以顯著降低瘤胃液中LPS和組胺的含量以及血漿代謝組的不良變化，減弱炎癥反應，緩解SARA帶來的不良影響。在奶牛的高精料飼糧中添加100 g/d富含黃酮類植物精油可以降低瘤胃液中LPS含量，同時降低血液中SAA、Hp和LPB的含量，進而減弱炎性反應[65]。Drong等[66]研究發現，在圍產期奶牛的高精料飼糧中添加含有百里酚、丁香酚和香草酚等的混合植物精油會降低瘤胃液中LPS含量，且Hp含量與對照組相比也有所降低。植物提取物可以緩解高精料飼糧條件下反芻動物發生SARA的癥狀，降低LPS的產生和炎癥反應，增強對腸道和肝臟等器官的保護作用，提高機體免疫功能。

3 小 結

奶牛由于代謝旺盛發生各種疾病，疾病的發生往往伴隨著氧化應激的產生，氧化應激又會導致促炎因子IL-1、IL-6和TNF-α的產生,進一步導致炎癥和免疫抑制的發生，機體抵抗力下降又會誘發其他疾病的風險，奶牛體內發生惡性循環導致奶牛機體健康受損。所以，了解奶牛體內氧化應激、炎癥與免疫失衡的三方聯動效應及其與代謝性疾病的關系具有重要意義。植物提取物作為一種來源廣泛的生物活性物質，參與細胞炎癥和細胞凋亡有關的信號通路，對緩解奶牛氧化應激、炎癥和增強免疫能力等方面具有廣闊的應用前景，有望作為奶牛的一種重要飼糧添加劑而對奶牛產生氧化應激和慢性炎癥時起到預防和治療作用。