SD大鼠術后急性疼痛向慢性疼痛轉化的差異代謝物分析

王國遼，林 輝，呂俊瑾，劉 鎮，程嬌嬌，唐雷雷，莫睿文，遠立國

(華南農業大學獸醫學院，廣州 510642)

術后慢性疼痛是指由手術引起、繼發于術后急性疼痛且持續時間超過3個月的慢性疼痛[1]。其病因復雜，機制未明，尚缺乏科學的干預手段和有效治療方案，對動物機體康復不利，導致醫療資源浪費，還嚴重影響生活質量，產生不良后果[2]。為明析術后慢性疼痛的機制和致病因素，實現動物“疼痛最小化”，獸醫工作者進行了大量研究。術后疼痛的實質是神經遞質和受體等物質參與的多維神經調節的結果，涉及多種物質變化[3]，但目前尚不明確究竟何種物質在其發生、傳遞和調制的過程中起決定作用。嚴重的術后急性疼痛是術后慢性疼痛的重要預測因素[4-5]，因此，甄別引發術后急性到慢性疼痛轉化這一復雜過程的關鍵物質，對術后慢性疼痛機制的深入研究和治療靶點的選擇尤為重要。

近年來，代謝組學技術的應用促進了疼痛相關物質研究的發展[6-8]，因此，本試驗擬用GC-MS代謝組學技術探討大鼠術后急性疼痛和慢性坐骨神經緊縮損傷疼痛模型(CCI)的相關代謝變化，以期篩選出術后急性向慢性疼痛轉化的關鍵物質及其相關代謝通路，為術后慢性疼痛的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent GC-MS氣質聯用儀(7890B-5977A)；Agilent DB-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；電子測痛儀；L-2-氯苯丙氨酸(上海恒創生物)；HPLC級氯仿、甲醇和正己烷(CNW，德國)；超純水由Milli-Q超純水儀制備，其余試劑均為市售分析純。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組及模型構建 SPF級SD大鼠65只，體重(250±10)g，南方醫科大學實驗動物中心提供，飼養于華南農業大學實驗動物中心。大鼠隨機分為空白對照組(n=5)、假手術組(n=30)和手術組(n=30)。參照Bennett等[9]的方法制作大鼠CCI模型，具體方法：大鼠經腹腔注射水合氯醛麻醉后剔除右側大腿被毛，消毒備皮。平行股骨外側作長約1 cm切口，撥開皮膚、筋膜和肌肉暴露坐骨神經主干。挑起坐骨神經主干并結扎，共4道，間距2 mm，結扎力度以小腿肌肉輕微顫動為宜，關閉切口；假手術組暴露坐骨神經但不結扎，其余操作同手術組；空白對照組不作任何處理。

1.2.2 機械縮足反射閾值測量 Von Frey電子測痛儀測定大鼠機械縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold，MWT)，大鼠于測痛裝置內適應環境30 min，將Von Frey刺激大鼠術側足底，力度由小到大，直至出現躲避反射即為其MWT值，重復測定5次，結果取平均值。

1.2.3 樣本采集與預處理 術前和術后第1、3、5、7、14、21天，大鼠經乙醚麻醉后，斷頭法處死，取下丘腦及胸椎T3～T5段脊髓經PBS沖洗后，液氮中保存。稱取樣品于離心管中，加入內標L-2-氯苯丙氨酸20 μL和600 μL甲醇水溶液，-80 ℃放置2 min， 研磨；加入120 μL氯仿。冰水浴超聲提取，4 ℃ 靜置。離心10 min(12 000 r·min-1, 4 ℃)，吸取400 μL上清液轉入衍生瓶中，揮干樣本。加入甲氧胺鹽酸鹽吡啶溶液80 μL進行肟化反應，隨后加入80 μL BSTFA衍生試劑和20 μL的正己烷。70 ℃ 孵育60 min，室溫冷卻后用于GC-MS檢測。每10個樣品中插入1個由所有樣本的提取液等體積混合制備的質控樣品(QC)。

1.2.4 氣相色譜-質譜檢測及數據分析 GC-MS檢測條件參考文獻[10]的方法并結合本試驗適當更改，質譜的離子源溫度為230 ℃，質量掃描范圍為50～500 m·z-1；氣相色譜進樣口溫度為260 ℃, 升溫程序見表1。GC-MS的原始數據由Anal-ysisBaseFileConverter和MS-DIAL軟件進行預處理，將手術組或假手術組在相同取樣時間的樣品數據歸為同一組，即手術組(D1、D3、D5、D7、D14、D21組)，假手術組(S1、S3、S5、S7、S14、S21組)；將數據導入SIMCA-P軟件中進行多元統計分析，找到組間差異代謝物，并將篩選出的差異代謝物以KEGG數據庫為背景，經MBRole進行代謝通路富集分析。

表1 氣相色譜升溫程序

2 結 果

2.1 機械縮足反射閾值

大鼠機械縮足反射閾值結果見圖1，結果顯示，大鼠MWT術前基礎值比較無顯著差異。模型建立后，手術組大鼠MWT較術前顯著降低，隨后逐漸恢復，直至術后第21天MWT值仍低于術前基礎值，差異顯著(P<0.05)，提示CCI模型建模成功。

圖1 大鼠機械縮足反射閾值Fig.1 The mechanical withdrawal threshold of rat

2.2 原始數據的質量控制與TIC圖

質控樣品的TIC疊加圖及單個代表性樣品TIC圖見圖2，結果表明，采用的分析方法具有良好的重復性和穩定性，分析程序合理。

2.3 數據的多變量統計分析

樣本PCA模型得分圖如圖3所示，QC樣本緊密分布，表明試驗具有較好的穩定性和重復性。為更直觀觀察組間差異，進一步建立每兩分析組間共11組的PCA、PLS-DA、OPLS-DA模型。PCA得分圖表明，組間分離趨勢明顯；PLS-DA模型解釋能力參數R2Y(0.842～0.995)，預測能力參數Q2(0.584～0.937)；OPLS-DA模型參數R2Y(0.842～0.991)，Q2(0.474～0.805)；在建立的OPLS-DA模型下進行200次響應排序檢驗考察模型的質量，各組模型預測能力參數Q2均在-0.925～-0.156；除D21/S21組的PLS-DA模型參數(R2X=0.491，R2Y=0.842，Q2=0.181)外，模型穩定性、預測能力均符合分析要求，模型未出現過擬合。以手術組D3和D5組兩組樣本的分析為例，見圖4。

2.4 差異代謝物的篩選

經多元統計分析、T檢驗和變異倍數分析(VIP>1，P<0.05，∣log2FC∣≥2)，從224種代謝物中篩選出35種代謝物作為候選差異代謝物，其中，24個 顯著下調，9個顯著上調，見表2。為表征候選差異代謝物間的聚落關系，對代謝物的定量信息進行層次聚類，見圖5；在候選差異代謝物中，N-乙酰天冬氨酸、泛酸、天冬氨酸、葡萄糖、β-丙氨酸、3-羥基丁酸與疼痛密切相關，可能是術后急性疼痛向慢性疼痛轉化的潛在生物標志物，為表征代謝物在不同時間的變化趨勢，對6種代謝物的平均表達量繪制箱線圖，見圖6。

A. 質控樣品TIC圖；B. 手術組大鼠樣品TIC圖 A. TIC of quality control samples; B. TIC of surgical group sample圖2 樣品的總離子流色譜圖 Fig.2 Total ions chromatogram

橫坐標表示第1主成分，即PC1，用t[1]表示；縱坐標表示第2主成分，即PC2，用t[2]表示 X-axis show the first principal component, t[1], Y-axis show the second principal component, t[2]圖3 所有分析樣本PCA得分圖Fig.3 PCA score plots of all sample group

2.5 代謝通路富集分析

將差異代謝物映射到KEGG數據庫中，通過 MBRole通路分析功能進行通路富集分析，結果35種候選差異代謝物參與了45個代謝途徑。代謝通路的P值表示該代謝通路富集的顯著性，以10為底取對數繪制代謝通路富集圖，P值越小，-lg(P-value)越大；圖中紅線和藍線分別示意P值為0.01和0.05(圖7)。

3 討 論

本試驗成功建立了大鼠術后急性疼痛和慢性坐骨神經緊縮損傷疼痛模型，并應用GC-MS代謝組學技術比較手術組與對照組、手術組D1、D3、D5、D7、D14、D21各組間的差異代謝物，鑒定出包括N-乙酰天冬氨酸(NAA)、泛酸、天冬氨酸、β-丙氨酸、3-羥基丁酸、葡萄糖等35種差異代謝物及45條潛在代謝通路可能參與了術后急性向慢性疼痛的轉化。

A、B、C分別代表樣本的PCA、PLS-DA、OPLS-DA得分圖；方形代表D3組的5個樣本，三角形代表D5組的5個樣本；得分圖的橫坐標表示第1主成分，即PC1，用t[1]表示；縱坐標表示第2主成分，即PC2，用t[2]表示；D是OPLS-DA模型的響應排序檢驗，縱坐標表示R2和Q2的取值 A, B, C show the sample score plots of PCA, PLS-DA, OPLS-DA, square mean 5 samples in the D3 group and triangles mean 5 samples in the D5 group of surgical group; X-axis show the first principal component, t[1], Y-axis show the second principal component, t[2]. D mean the permutation test for OPLS-DA model, Y-axis mean the value of R2 and Q2圖4 兩組樣本得分圖Fig.4 Sample score plots of two group

圖5 各組分析樣本差異代謝物熱圖Fig.5 Heatmap of differential metabolites in each sample group

A. N-乙酰天冬氨酸; B. β-丙氨酸; C. 3-羥基丁酸; D. 天冬氨酸; E. 葡萄糖; F. 泛酸 A. N-acetylaspartic acid; B. Beta-alanine; C. 3-hydroxybutyric acid; D. Aspartate; E. Glucose; F. Pantothenic acid圖6 代謝物平均表達量箱線圖Fig.6 Box plots of average metabolites expression

A.D 1組vs D 3組；B. D 3組vs D 5組；C. D 5組vs D 7組；D. D 7組vs D 14組；E. D14組vs D21組 A.Group D 1 vs group D 3; B. Group D 3 vs group D 5; C. Group D 5 vs group D 7; D. Group D 7 vs group D 14; E. Group D 14 vs group D 21圖7 代謝通路富集圖Fig.7 Enrichment map of metabolic pathways

N-乙酰天冬氨酸是衡量神經細胞破壞程度的標志物[11]，濃度降低提示神經元丟失、結構破壞或功能異常[12-13]。應用核磁共振波譜技術(MRS)，發現慢性疼痛患者經顱直流電刺激治療后，疼痛程度減輕，且腦代謝物中NAA濃度較治療前顯著升高[14-15]。進一步研究發現NAA的濃度與疼痛的強度呈負相關[16]，本試驗中，NAA濃度在術后D1vsD3組和D14vsD21組中表達下調，與這些研究結果相同，其平均表達量與MWT值變化趨勢一致，說明NAA在急性向慢性疼痛轉化的過程中發揮了作用。

泛酸以輔酶A的生物活性形式揮發其功能，參與含碳架物質的能量代謝[17]，其表達失調表明機體能量失衡。神經損傷后釋放大量ATP，作用于P2X3受體參與傷害性信息的傳遞和痛覺敏化[18-19]。本試驗中泛酸濃度下調，其代謝紊亂引起的能量失衡可能導致信號傳導異?；蚣毎麅韧怆x子交換障礙，從而在術后急性疼痛向慢性疼痛轉化過程發揮作用。輔酶A也是機體應激反應重要觀測指標皮質醇的必需輔助因子[20]，傷害性信號促使下丘腦-垂體-腎上腺皮質軸興奮增強，皮質醇等應激激素水平升高，引起術后應激反應，進而導致糖代謝紊亂[21]。葡萄糖是腦細胞能量代謝的最主要的直接來源，本試驗中葡萄糖濃度下調，可能是手術傷害性刺激引起神經元的活性增強、代謝旺盛，從而參與疼痛的形成。

表2 主要差異代謝物及其相關代謝通路

(轉下頁 Carried forward)

β-丙氨酸為不參與蛋白質合成的氨基酸，與主要的抑制性神經遞質甘氨酸和γ-氨基丁酸結構相似，能夠激活甘氨酸和γ-氨基丁酸受體，進而影響突觸的可塑性[22-23]。傷害感受器可塑性變化在急性疼痛向慢性疼痛轉化中具有重要作用[24]。試驗結果發現β-丙氨酸代謝紊亂，說明其可能通過調控神經系統的可塑性變化從而參與了術后急性向慢性疼痛轉變的過程。

天冬氨酸是重要的興奮性氨基酸類神經遞質，參與維持神經系統的結構與功能，濃度過高會介導神經元的死亡。本試驗天冬氨酸濃度升高，提示手術引起的傷害性刺激傳入脊髓背角使神經突觸和膠質細胞釋放大量的天冬氨酸[25]，天冬氨酸等興奮性氨基酸過度釋放會導致NMDA受體上調，使突觸的可塑性出現長時程易化，造成中樞敏化[26]，從而參與了術后慢性疼痛的形成。

3-羥基丁酸具有多種生物活性，可以為神經膠質細胞提供能量，并通過抗氧化、線粒體保護和增加腦源性神經營養因子的表達等方式對神經起到保護作用[27]，同時還可以抑制神經膠質細胞的凋亡。胡華輝等[28]發現3-羥基丁酸在急性脊髓損傷模型大鼠脊髓中濃度降低，與本試驗中3-羥基丁酸在手術組D7vsD14組中表達下調相似，說明其參與了疼痛形成過程中神經保護與修復的過程。3-羥基丁酸還可以作為表觀遺傳修飾調控因子發揮功能，預示其可能在疼痛的表觀遺傳調控中發揮功能[29-30]。

4 結 論

使用GC-MS代謝組學技術對大鼠術后急性疼痛和慢性坐骨神經緊縮損傷疼痛模型的下丘腦和脊髓代謝物進行初步研究，篩選出N-乙酰天冬氨酸、泛酸、天冬氨酸、β-丙氨酸、3-羥基丁酸、葡萄糖等35種物質可能與術后急性疼痛向慢性疼痛轉變密切相關。但由于試驗條件和試驗設計的限制，這些差異代謝物在術后疼痛中的作用及其具體機制仍有待進一步深入研究。