靶向老化細胞的延衰新策略

祁均梅 楊凱業 林豪杰 許諾 丁明 胡振林

(1溫州大學生命與環境科學學院，浙江 溫州 325035；2無限極(中國)有限公司；3溫州大學生命科學研究院)

衰老是許多常見疾病包括癌癥、心血管疾病、糖尿病和神經退行性疾病等的主要危險因素。了解衰老的機制并加以針對性的干預，有助于衰老相關疾病的防治，但衰老的生物學機制極其復雜，迄今尚未闡明。較早的抗衰老策略主要基于抗氧化應激，但膳食補充抗氧化劑臨床試驗并沒有給出明確的結論。其他的抗衰老策略如熱量限制(CR)，雖然實驗依據充分，但只能在動物身上有效地實施，難以在人體中有效進行。近年來隨著對衰老機制研究的不斷深入，出現了多種新的抗衰老策略，包括靶向調控腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、去乙酰化酶(Sirtuin)和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)等控制衰老進程的信號通路、誘導自噬、激活端粒酶、激活質膜氧化還原系統、表觀遺傳學調控、干細胞療法等。本文對細胞老化導致機體衰老的機制及針對老化細胞延衰策略的最新研究進展進行綜述。

1 老化細胞在體內的堆積是機體衰老的重要因素

機體衰老通常伴隨著皮膚衰老、行動變得遲緩、聽覺嗅覺的消退等特征。在分子及細胞水平上，衰老的特征包括基因組的不穩定性增加、端粒損耗、線粒體功能失調、營養狀況感應失調、蛋白質穩態喪失、細胞間通訊改變、細胞老化和組織再生能力減弱等〔1〕。細胞老化與機體衰老有著十分密切的聯系〔2〕。

細胞老化可由端粒縮短、DNA損傷、氧化應激、線粒體功能障礙及其他衰老相關因素誘發。長期的細胞周期阻滯是老化細胞的最基本特征〔3〕，主要表現為G1 期阻滯，在個別情況下也可伴隨著G2/M期周期阻滯，或由G2/M期阻滯誘發形成〔4，5〕。除增殖停滯外，老化細胞會持續表達一系列促炎細胞因子、趨化因子、生長因子及基質金屬蛋白酶(MMP)等，稱為老化相關的分泌表型(SASP)。介導細胞老化的信號通路主要是p53/p21CIP1和p16INK4A/Rb通路〔6〕。p53和p16INK4A作為細胞老化過程中的關鍵節點，能感受細胞內眾多應激壓力的改變而被激活，如原癌基因的異常表達、端粒功能異常、DNA損傷和活性氧(ROS)的累積等〔7〕。在p53所調控的眾多下游基因中，p21CIP1在細胞老化中的作用最為突出，它不但可抑制周期蛋白依賴性激酶(CDK)1進而誘使細胞發生G2/M期阻滯，還可以抑制CDK2和CDK4的活性，降低Rb磷酸化水平，使細胞無法進入S期〔8〕。在老化細胞中，非磷酸化的Rb聚集在E2啟動結合因子(E2F)1上，阻止E2F1下游促增殖靶標基因的轉錄，是細胞老化過程中另一重要的信號節點〔9〕。p16INK4A則通過與CDK4 和CDK6結合，阻滯其與CyclinD結合，抑制CyclinD-CDK復合物的活性，抑制有絲分裂原刺激誘導的Rb蛋白磷酸化，使細胞阻滯在G1期，從而維持衰老細胞不可逆的生長停滯狀態〔10〕。

細胞老化對機體具有正反兩方面的作用。在年輕的生物體內，細胞老化可阻止受損細胞的增殖，從而防止其進一步癌變。同時，年輕生物體內強大的免疫系統可識別并及時地清除掉老化細胞，防止老化細胞的積累。另一方面，隨著機體衰老，端粒不斷縮短，DNA暴露于各種誘變劑的機會增多，病毒DNA整合進入基因組的概率也增加，造成越來越多的細胞進入老化狀態，同時機體免疫系統功能也逐漸衰退，導致大量的老化細胞不能被及時清除而在體內聚集積累，從而對組織穩態產生毒性效應，進而促使衰老。如在對小鼠進行基因突變誘導早衰時，發現其老化細胞數量迅速增加，而若敲除其體內p16INK4a或p53基因，則早衰表型有所減輕，說明兩者通過誘導細胞老化以促進病理性衰老〔11，12〕。

老化細胞對機體的正反兩方面的影響在很大程度上是由于其老化相關的分泌表型(SASPs)。老化細胞所分泌的SASP因子由一百多種不同的分泌蛋白組成。一方面，SASP因子可募集自然殺傷細胞和巨噬細胞等免疫細胞，有助于清除老化細胞和鄰近的腫瘤細胞，即所謂的老化細胞免疫監督功能〔13〕，而且在創傷修復過程中，SASP因子可促進修復或限制修復所致的過度纖維化，促進傷口愈合〔14〕。另一方面，持續釋放的SASP因子會導致低水平的炎癥反應，引起組織結構的改變和功能的喪失，并引發一些跟衰老相關的慢性疾病，如SASP因子中的血管內皮生長因子是直接促成黃斑變性的病理性原因〔15〕；MMP-3和白細胞介素(IL)-6與骨關節炎有關〔16〕。老化皮膚細胞所分泌的 SASP因子的重要組成成分MMPs能降解幾乎所有的細胞外基質，包括膠原蛋白、彈性纖維、蛋白聚糖、纖維粘連蛋白和板層素膠原纖維等，這些變化使得皮膚的支撐結構喪失，皮膚彈性下降，導致老化皮膚松弛和皺紋形成〔17〕。

2 靶向清除老化細胞或抑制其SASP表型具有顯著的延衰作用

在不同的組織器官中，老化細胞會隨著年齡的增加而積聚，且由于老化細胞持續釋放的SASP因子會影響到周圍組織的結構和功能，因此老化細胞的積累是衰老及相關疾病的重要病理基礎，而靶向清除老化細胞能有效地改善老年機體的衰老癥狀〔18，19〕。

2.1選擇性老化細胞溶解劑-Senolytics的延衰作用 老化細胞之所以能夠在增殖停滯狀況下持續存活而不發生死亡或凋亡，主要是由于其細胞內的促存活或者抗凋亡信號通路過度活化所致，包括Ephrin(EFN)B 、B細胞淋巴瘤超大蛋白(Bcl)-xl、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、p21WAF1、纖溶酶原激活物抑制因子(PAI)-2等信號通路〔20〕，因此這些信號通路的抑制劑有可能選擇性地誘導老化細胞凋亡，進而溶解老化細胞〔21〕，而這些能夠選擇性誘導老化細胞溶解的藥物就被稱為Senolytics。Ephrin B抗凋亡通路的抑制劑達沙替尼是第一個被發現的Senolytics，Zhu等〔20〕研究發現達沙替尼與槲皮素(PI3K通路抑制劑)聯合使用可選擇性地誘導老化細胞凋亡，有效減緩衰老小鼠模型的衰老進程，延長治療小鼠的壽命。隨后，多種Senolytics被發現，如Zhu等〔22〕發現Navitoclax能抑制Bcl-2、Bcl-w及Bcl-xl活性，進而阻止老化細胞繼續存活。Baker等〔18〕發現，在轉基因INK-ATTAC快速衰老小鼠模型中，使用小分子AP20187通過膜結合的肉豆蔻?；疐K506結合蛋白(fkbp)-半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)8二聚反應誘導老化細胞凋亡，清除p16陽性的老化細胞，可使小鼠年輕6個月，相當于人類年輕數十年。Baar等〔19〕用小干擾RNA(siRNA)敲減p53的抑制蛋白叉頭框轉錄因子(FOX)O4或者以小肽阻斷FOXO4與p53的結合從而激活p53的促凋亡活性，發現能選擇性地誘導老化細胞凋亡，體內給予這種老化細胞凋亡誘導肽能顯著改善快速衰老轉基因小鼠和自然老化小鼠的衰老癥狀，包括腎功能和毛發密度等，并且沒有產生任何不良反應。迄今，已經報道的Senolytics已累計十幾種，包括小分子、抗體和多肽等。這些新的研究表明機體組織器官的衰老與老化細胞的堆積直接相關，而靶向清除這些老化細胞具有顯著的延衰作用，甚至可使機體年輕化。值得注意的是，每種Senolytics只對特定組織來源的老化細胞有效，因此針對不同的老年疾病，可能需要不同類型的Senolytics。與其他的延衰策略相比，直接靶向清除老化細胞存在以下優勢：理論上只需定期應用Senolytics清除衰老細胞即可起到延衰作用，可減輕或避免不良反應的產生；與癌癥治療不同，衰老相關疾病防治無需清除組織中所有的老化細胞，動物研究表明〔23〕，清除部分老化細胞就足以產生顯著的抗衰老效應；Senolytics只影響已存在的老化細胞，而不會影響這類細胞的形成，這意味著老化細胞本身所具有的腫瘤抑制功能仍可保留。

2.2抑制SASP表型也可產生延衰作用 由于老化細胞對機體的不良作用主要由其分泌的SASP因子所介導，因此抑制老化細胞的SASP表型也可能產生延衰效應。有研究表明，老化細胞的SASP表型與多條信號通路的過度活化有關，包括p38 MAPK、MK2〔24〕激酶、核因子(NF)-κB〔25〕、IL-1A〔26〕、CAAT增強子結合蛋白(C/EBP)β〔27〕、Sirt1〔28〕及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)+/還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)氧化還原平衡〔29〕等。已經報道一些植物天然化合物能通過抑制上述信號通路來抑制老化細胞的SASP表型，如NF-κB通路抑制劑包括芹菜素(apigenin)、漢黃芩素(wogonin)等〔25〕，IL-1A信號通路抑制劑雷帕霉素(rapamycin)〔26〕及Sirt1激活劑白藜蘆醇(resveratrol)〔30〕均能通過抑制老化細胞的SASP表型來發揮一定的延衰作用。

3 增強免疫系統的免疫監督功能是靶向清除老化細胞的潛在途徑

老年機體內的老化細胞之所以能持續存在，一定程度上是由于老年機體的免疫系統機能降低，不能及時清除不斷形成的老化細胞所致。其實，在年輕機體組織中老化細胞也會不斷產生，但可被免疫細胞及時清除，因此老化細胞不會堆積。但老年機體免疫力下降，不能及時清除老化細胞，致使老化細胞不斷堆積。

正常生理情況下，機體的免疫細胞能夠識別并及時清除老化細胞，以維持內環境的穩定，免疫系統的該項功能被稱為老化細胞免疫監督功能〔31〕。執行該功能的免疫效應細胞包括自然殺傷(NK)細胞、巨噬細胞等天然免疫細胞和細胞毒性T淋巴細胞等特異性免疫細胞〔31〕。NK細胞是目前最為明確的執行老化細胞免疫監督功能的非特異性免疫細胞，在NK細胞和誘導老化的肺成纖維細胞共培養系統中，可直接觀測到NK細胞對老化細胞的選擇性殺傷作用〔32〕。NK細胞最早被發現能以不依賴主要組織相容性抗原的方式殺傷腫瘤細胞和感染了病毒的細胞，因此一直被認為是機體免疫防御的第一道重要防線。隨后研究發現許多細胞在應激狀況下都會上調一些應激蛋白如主要組織相容性復合物Ⅰ類相關鏈(MIC)A和UL16結合蛋白(ULBP)2的表達，而這些應激蛋白可被NK細胞表面的NK細胞活化性受體2群成員(NKG2D)受體識別，進而介導NK細胞對應激細胞的清除。最近的研究發現老化細胞也會高表達這些應激蛋白并被NK細胞的NKG2D受體識別，進而以顆粒胞吐作用的方式殺滅老化細胞〔33〕。在小鼠肝纖維化模型的實驗研究中，NK細胞顆粒胞吐作用的缺陷和NKG2D的基因敲除均會導致老化的星狀細胞在肝臟的堆積和肝纖維化的加劇〔33〕。

除NK細胞外，巨噬細胞在老化細胞免疫監督中的作用也引起了越來越多的關注〔31〕。巨噬細胞是功能強大的吞噬細胞，體內實驗研究表明巨噬細胞和NK細胞一樣能夠被募集至老化細胞周圍，并介導對老化細胞的清除。耗竭小鼠體內的巨噬細胞會導致老化細胞免疫監督功能極大地削弱，致使老化細胞的堆積，在老化細胞和巨噬細胞的體外共培養系統中，老化細胞能夠影響巨噬細胞的激活狀態，進而誘導其靶向殺傷老化細胞〔34〕。巨噬細胞識別老化細胞的機制可能與其識別凋亡細胞的機制類似，凋亡細胞會表達一些特定的細胞表面抗原作為“eat me”信號，被巨噬細胞的清除劑受體識別，介導其對凋亡細胞的吞噬清除。與之類似，老化細胞也會特異表達某些表面抗原，包括氧化修飾的膜蛋白vimentin和氧化修飾的脂質等，其可作為模式識別配體被巨噬細胞的清除劑受體CD36和晚基糖基化終產物受體(RAGE)等識別，介導其對老化細胞的吞噬清除〔31〕。隨著年齡的增加，上述免疫細胞的遷移能力和殺傷靶細胞的功能會逐漸減弱，因此不可避免地導致老化細胞在體內堆積，進而導致組織器官的功能衰退。鑒于免疫細胞在靶向清除老化細胞中的重要作用，免疫增強策略將有利于靶向清除老化細胞以延緩衰老和緩解老年相關的疾病。這一概念近年來已經取得了一些實驗證據的支持，如在肝纖維化小鼠實驗中，給予免疫激活劑能夠加強NK細胞介導的老化星狀細胞的清除，緩解模型小鼠的肝纖維化〔35〕。

綜上，與延長壽命相比，發展病理性衰老的防治方法更加有益。細胞老化與機體衰老的關系非常密切，而靶向老化細胞的抗衰老策略有望成為安全高效的延衰新策略，該策略主要包括應用Senolytics直接清除老化細胞、抑制老化細胞的SASP表型和增強免疫系統的老化細胞免疫監督功能促進其間接清除老化細胞等方法。盡管在動物實驗中取得了很好的延衰效果，該策略在應用于人類之前還需要大量長期的臨床研究。