抗體模擬物及多肽的研究進展及應用前景①

譚小艷 李翀 顧大勇 何建安 龍軍（南方醫科大學珠江醫院檢驗醫學科，廣州510280）

抗體是一類重要的生物藥物，由于它們與抗原的高親和力和特異性的相互作用及單克隆抗體技術的不斷發展，在臨床治療和診斷方面起著舉足輕重的作用，但也存在許多局限性，如藥代動力學不足、組織可及性差、免疫原性不良和生產成本高，且抗體分子量大，穿透性差，限制了其廣泛使用。目前，針對目標抗原的合成多肽及多肽的模擬物是抗體的重要替代品，如來源于互補決定區（complementarity determining region，CDR）的某些小分子多肽可以替代其源抗體，發揮與完整抗體相同的生物功能和特異性結合［1-2］。抗體模擬技術是在20世紀90年代才發展起來的一種新興技術，有文獻稱，CDR區的幾個關鍵氨基酸序列在抗體與抗原的界面相互作用及特異性結合之間占據著重要地位，尤其是免疫球蛋白重鏈互補決定區3（HCDR3）區，基因的連接、組合和重排機制，成為人類抗體庫廣泛多樣性的原因［3］。因此如果將該結合部位的氨基酸殘基分離出來，并通過計算機模擬及化學合成的方式維持其在結合位點上的空間構象，尤其是CDR區的轉角構型，在維持抗體的功能和特異性方面起著非常重要的作用，理論上能夠得到與抗原特異性結合的小分子抗體模擬物［4］。

1 抗體的結構及其與抗原結合的特點

抗體是免疫系統受刺激后產生的一種蛋白質，其作用是靶向中和病原體和毒素。抗體呈Y字型的四聚體結構，含兩條相同的重鏈和兩條輕鏈。Y字的頂端由重鏈和輕鏈可變區組成，在可變區有小部分氨基酸變化特別強烈且其殘基和排列順序等易發生變異，該位置被稱為高變區，也即CDR區［5-6］。另外，抗體可經木瓜蛋白酶水解成一個結晶片段（Fc片段）和兩個抗原結合片段（Fab片段），抗體的主要治療是基于抗蛋白質的抗體阻斷蛋白質的配體結合位點來抑制疾病相關的蛋白質——配體相互作用，該作用由抗體的可變區（Fv）介導。另一方面，抗體的細胞毒性作用與其Fc結構域相關，其通過與自然殺傷細胞（NK細胞）、巨噬細胞和樹突細胞上的Fc受體，以及補體蛋白的相互作用誘導靶細胞裂解［7-8］。

不同抗體CDR區的氨基酸殘基種類、數量和氨基酸序列各不相同。由于抗體具有多樣性的巨大潛力，HCDR3被認為是抗體分子在賦予結合活性和特異性方面最重要的成分，尤其是HCDR3空間構象（如β-轉角、環狀結構等）的多樣性與抗體的多樣性密切相關。因此，HCDR3成為獨特的標識符，用于研究體內適應性免疫應答。如齊靜等［9］以抗P-糖蛋白單克隆抗體（PMHA02）為模板，通過單鏈抗體三維結構的方式，在該抗體的HCDR3區β轉角插入半胱氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸及芳香族氨基酸修飾的環肽（據報道，其可以增加抗原與抗體結合的穩定性，并維持CDR樣轉角構型［10］），由此設計了抗P-糖蛋白抗體的十四環肽模擬物，并證實該抗P-糖蛋白抗體肽模擬物可以與PMHA02抗體競爭結合K562/A02細胞，也就是說該模擬物對P-糖蛋白具有相同結合活性。

2 小分子抗體模擬物及多肽的應用

2.1 CDR來源性多肽以多肽、蛋白質類治療劑為先導物，利用化學合成的方法合成蛋白質多肽類治療劑的非肽小分子模擬物可解決蛋白質、多肽類治療劑存在的缺點。這種小分子模擬物保持先導物藥效基團的有效空間排布及其功能構象，因此具有與先導物相同的生物功能［11-13］。有大量證據表明HCDR3是抗體結合特異性的主要決定因素，如：從合成抗體文庫中選擇特異性抗體，其多樣性僅限于HCDR3。有文獻稱，僅相同的文庫與LCDR3多樣性組合時，從含有HCDR3多樣性的合成文庫中能選擇更多數量的抗體，進一步證實了HCDR3在抗體多樣性方面的重要性［14-15］。PERSSON等［16］在重鏈（CDRH3）和輕鏈（CDR-L3）的第三互補決定區中構建了具有相同化學多樣性的合成噬菌體展示抗體庫，由于產生抗體編碼基因的遺傳機制，CDR-H3比CDRL3更加多樣化。更令人驚訝的是，合成的組庫產生了許多功能性抗體，這些功能性抗體都具有固定的CDR-H3序列。另外，在識別10種不同抗原的丙氨酸掃描分析中發現，含有共同且固定的CDR-H3環的抗體序列能夠有力地促進抗原識別。以上結果與從天然抗體分析得到的抗原識別觀點形成對比，該學者推測在抗原識別的過程中，抗體的CDR-H3環起主要作用，而CDR-L3起輔助作用。

除展示文庫外，具有限于HCDR3的抗體多樣性的轉基因小鼠能夠在體內產生高親和力反應［5］。進一步的證據表明，HCDR3是抗體結合特異性的主要決定因素，這是由于從HCDR3結構中提取的肽可以表現出抗體的生物活性，甚至有案例表明這種提取的多肽能達到治療性抗體的作用，如TIMMERMAN等［17］利用CDR區構建抗胃泌素G17的多肽藥物，眾所周知，胃泌素肽是調節胃酸分泌的激素，并且可以作為胰腺癌、胃癌和結腸、直腸癌的生長因子。胃 泌 素17（pyroEGPWLEEEEEAYGWMDF-NH2，G17）是最具生物活性的形式之一，這使得它成為開發治療性抗體的一個有趣的靶點。因此該研究團隊通過用苯環結構的基質平臺將輕鏈及重鏈可變區的幾段序列互配，合成雙環肽、單環肽、三環肽等結構，利用此結構開發了相關性好的抗胃泌素結合物。其中含CDR3區的雙環肽經ELISA實驗驗證具有較高的OD值，三環肽經表面等離子共振體（surface plasmon resonator，SPR，利用光學折射的原理檢測生物傳感芯片上配體與分析物之間相互作用的情況）檢測反應強度最高。

因為在大多數情況下，天然來源的CDR3肽表現出很低的活性和親和力，因此需要對其序列進行分析以解決多肽缺乏抗體結構域問題。在QIU等［18］的研究中，通過篩選溶菌酶免疫的噬菌體展示VHH文庫，在側翼鑒定了具有框架3（FR3）和FR4的CDR3結構域抗體。該抗體具有有效的酶抑制活性和高熱穩定性。通過序列比對和定點誘變分析，發現FR3中氨基酸位置為88處的半胱氨酸殘基可能在維持CDR3抗體的穩定性中起關鍵作用。另外，KADAM等［19］利用CR9114和FI6V3這兩個可以結合在流感病毒血凝素中間部分的保守位點的廣泛中和抗體來合成肽段，因CR9114的作用位點在CDR區及框架區，而FI6V3作用點為CDR區，因此選擇CR9114的框架區及FI6V3的CDR區，中間用非蛋白質氨基酸連接后形成肽段，該多肽具有空間構象，應用于檢測特異性良好。證實小分子CDR3結構域抗體可以作為親和力轉移的新支架，因此對理解抗原——抗體相互作用有著實質性的指導意義。

2.2 非CDR源性多肽抗體是一類重要的生物藥物，但存在局限性，如藥代動力學不足，免疫原性不良和生產成本高。針對目標的合成多肽是抗體的重要替代品，然而，肽的設計需要計算工具來指導設計。為了識別特定抗體-抗原（Ab-Ag）界面的相互作用殘基，VIART等［20-21］采用了界面相互作用殘基（I2R），一種基于分子相互作用計算的選擇方法。表位和互補位殘基之間所有分子相互作用的聚集使其能夠將三維Ab-Ag復合物結構轉化為界面圖。基于這些數據和分子相互作用的概率，開發了表位-互補位相互作用的多肽設計工具（EPI-Peptide Designer），該工具使用預測的互補位殘基作為目標表位以產生靶向肽配體文庫。并且使用EPI-Peptide Designer成功預測了301種能夠與LiD1靶蛋白（一種在棕色蜘蛛Loxosceles的毒液腺中表達且具有皮膚壞死活性的蛋白質［22-23］）結合的肽（65%能與LiD1結合），比隨機產生的肽高出22%的結合率。該工具應該能夠開發新一代合成相互作用肽，這些肽在生物傳感器，診斷和治療領域非常有用。

除此之外還有非CDR源性多肽，如噬菌體展示肽文庫可通過多種方式在其表面展示不同的肽，①可以利用已知的蛋白質折疊（如鋅指折疊、芋螺毒素折疊、免疫球蛋白折疊或胱氨酸結），在這些三級折疊上隨機接枝寡肽；②利用巰基反應性化合物或交聯劑對其進行化學修飾，在篩選前對顯示肽段進行有限的環化和衍生化（如用兩個半胱氨酸形成二硫鍵形成簡單的環肽）；③通過改變環大小和氨基酸手性、加入限制性結構單元或者修改某個殘基從而在環肽區域引入附著手柄，能夠在獲得具有重要意義的結合肽的同時，使得其結合親和力和特異性得 到 進 一 步 改 善［24］。如KHASRAW等［25］通 過 在RGD環肽（RGD可與整合素特異性結合，能有效地促進細胞對生物材料的黏附）上引入受約束的結構單元如N-甲基化氨基酸，從而發現了一種具有序列的頭尾環肽——西侖吉肽，其臨床研究中表明西侖吉肽在小鼠中具有明顯的腫瘤消退作用，同時它還是復發性膠質母細胞瘤患者的潛在單藥治療；MAASS等［26］獲得的結合于CTLA-4細胞外結構域的胱氨酸-結肽（CTLA-4為T淋巴細胞表達的抑制性受體）已成為治療轉移性黑素瘤的靶標。胱氨酸結（也稱為knottins）是小而緊湊的肽（通常為20～60個氨基酸），由至少3個二硫鍵的核心組成，它們交織成“結”構象，將含有4個環的環狀物與神經曲霉素偶聯，融合到抗體Fc結構域或結合蛋白的寡聚結構域，使離解常數在納米范圍內增強。

多肽及其模擬物設計的目標是引入新的生物活性或者以小分子還原劑發揮源抗體的功能作用。NIMROD［27］提出了一種通過關注功能性表位來設計功能性抗體的計算方法，將大規模統計分析與多種結構模型相結合，設計了一種功能性抗體以抵抗細胞因子白細胞介素-17A（interleukin，IL-17A）的促炎作用。基于細胞的分析證實抗體是有功能的，X射線晶體學證實設計的抗體可以結合靶向表位，并且其相互作用由設計的靶點介導。重要的是，這種方法不依賴于設計復雜的高質量3D模型或甚至目標的解決結構。且該方法可用于設計生物活性抗體，消除抗體設計和藥物發現中的一些主要障礙。

3 展望

在過去的十年中，批準臨床使用的抗體數量急劇增加，利用多肽代替抗體具有制造成本低、免疫原性低、穩定性好、器官/腫瘤穿透力強等優點。事實上，目前許多研究工作都集中利用肽模擬物作為抗體的一種可行的替代靶向治療，或者是應用于藥理學基礎研究，在臨床診斷應用方面尚缺乏有效的實驗證據支持，因此還需要進一步對抗體的結構和功能進行探索，在氨基酸分子水平上繼續研究多肽抗體與抗原之間的相互作用，探究抗體的部分氨基酸殘基及結構對抗原的結合力產生的影響，并利用該技術合成與源抗體發揮相同作用的高活性多肽抗體模擬物，以期將該模擬物應用于臨床診斷。