γδT細胞對腫瘤發生、發展的影響及其在腫瘤免疫治療中的應用①

劉玉霞 張彩（山東大學藥學院免疫藥物學研究所，濟南250012）

γδT細胞是一群性質獨特的固有免疫細胞，主要分布于皮膚、黏膜等部位，參與多種免疫應答和免疫調節的過程，如介導免疫炎癥反應、直接識別并殺傷腫瘤等［1］。γδT細胞識別抗原無MHC限制性，能夠迅速地對多種入侵的病原體產生免疫應答，被稱為是抵抗外來感染的第一道防線。γδT細胞不僅在抵抗外來感染中發揮著重要的作用，在腫瘤免疫中也發揮著重要的作用。研究發現γδT細胞對多種腫瘤如乳腺癌、結腸癌、肺癌具有積極的抗腫瘤作用，可以通過其強大的細胞毒作用直接殺傷腫瘤細胞，也可以間接的通過影響其他免疫細胞的功能發揮抗腫瘤作用，如增強樹突狀細胞呈遞抗原的能力、增強細胞毒性T細胞對腫瘤細胞的殺傷能力等［2］。然而，也有研究表明γδT細胞具有促腫瘤作用。如分泌IL-17的γδT細胞亞群，即γδT17細胞，是腫瘤微環境中IL-17的主要來源。IL-17可以通過促進非小細胞性肺癌、胃癌、膽囊癌等腫瘤組織的血管生成促進腫瘤的發展。γδT17細胞還能招募MDSC（骨髓來源的抑制細胞）到腫瘤部位，抑制免疫細胞殺傷腫瘤的功能進而促進腫瘤的生長［3］。

由此可見，γδT細胞作為機體免疫防御的第一道防線，在抗腫瘤作用中發揮著重要的作用［4］。但是，腫瘤微環境的長期影響會調控γδT細胞的功能，使γδT細胞轉變為促進腫瘤進展的細胞亞群，如γδT17細胞亞群、調節性γδT細胞（γδ Treg）亞群等。本文就γδT細胞及其主要亞群、γδT細胞識別腫瘤及其殺傷腫瘤的機制、γδT細胞促進腫瘤發生、發展的機制以及γδT細胞在免疫治療中的作用等方面做一綜述。

1 γδT細胞亞群的分類

目前對于γδT細胞亞群的分類主要有3種方法。①根據TCRγ或δ的組成進行分類。通常人的γδT細胞根據TCRδ的組成不同分為三大亞群，即Vδ1+、Vδ2+、Vδ3+γδT細胞，各個亞群的分布和特點不完全相同［5］。Vδ1+γδT細胞主要分布于皮膚、小腸等黏膜組織，在脾臟、肝臟中也有發現，Vδ1+能夠和多種Vγ鏈（如Vγ2、Vγ3、Vγ5和Vγ8等）共表達，組成不同的γδT細胞亞群。Vδ1+γδT細胞對慢性淋巴系白血病細胞具有特異性的細胞毒性［6］。Vδ2+γδT主要存在于外周血中，是參與血液循環的主要γδT細胞，在TCRγδ重排過程中，Vδ2幾乎只和Vγ9共表達，Vγ9Vδ2γδT細胞能夠識別磷酸化抗原，具有很強的抗腫瘤能力，能夠抑制腫瘤細胞的增殖并促進腫瘤細胞的凋亡［7］。Vδ3+γδT細胞主要存在于肝臟和小腸上皮，目前關于其對腫瘤進程影響的研究還很少［8］。而小鼠γδT細胞則通常根據TCRγ鏈進行分類，可分為6個亞群，通常采用“Heilig命名法則”對其命名，分別是Vγ1+、Vγ2+、Vγ4+、Vγ5+、Vγ6+與Vγ7+γδT細胞亞群［9］。②根據γδT細胞表型進行分類。目前有許多表面標記可以用于γδT細胞亞群的分類，如CD27、CD44、Ly-6C等。目前最公認的標志是CD27，根據CD27的表達可以將小鼠γδT細胞分為CD27+γδT細胞和CD27-γδT細胞，這兩群細胞分泌的細胞因子不同，通常認為CD27+γδT細胞主要分泌IFN-γ，而CD27-γδT細胞主要分泌IL-17。此外，還可以根據CD27和CD45RA的表達，將其分為4個亞群，即幼稚型（CD27+CD45RA+）、效應記憶型（CD27-CD45RA-）、中央記憶性（CD27+CD45RA-）和終末分化型（CD27-CD45RA+）γδT細胞［10］。③根據γδT細胞的功能進行分類。與αβT細胞類似，γδT細胞也可以根據功能的不同分為不同的亞群，如γδT1、γδ T17、濾泡輔助性γδT（γδTfh）、調節性γδT（γδTreg）與記憶性γδT（memory γδT）細胞等［11］。γδT1細胞是指分泌IFN-γ的γδT細胞，γδT17則是指分泌IL-17的γδT細胞。γδTfh細胞與傳統的Tfh細胞的功能類似，能夠促進B細胞的成熟和產生抗體的能力［12］。γδTreg細胞能夠表達一種特異性的轉錄因子FOXP3，具有免疫抑制功能［13］。Memory γδT細胞具有免疫記憶的特點，在再次接受同一抗原刺激后能夠迅速產生免疫反應［14］。

2 γδT細胞抗腫瘤作用的機制

2.1 γδT細胞識別腫瘤細胞的機制識別腫瘤細胞是γδT細胞能夠殺傷腫瘤的基礎。γδT細胞識別腫瘤抗原主要通過TCR依賴和NKR依賴的兩種方式［15］。Vγ9Vδ2γδT細胞主要通過TCR依賴的方式識別腫瘤相關抗原，最早發現的是Vγ9Vδ2γδT細胞能夠通過TCR依賴的方式特異性地識別非肽類的磷酸化抗原，如異戊烯焦磷酸（IPP）［16］。在正常組織內，細胞會經甲羥戊酸代謝途徑合成類異戊二烯（isoprenoid）參與膽固醇的合成，在此過程中也會生成少量的IPP。而在腫瘤組織中為了滿足腫瘤的能量供應，甲羥戊酸代謝途徑增強，會導致IPP在細胞內的累積超出正常生理范圍，從而被Vγ9Vδ2γδT細胞識別并殺傷［17］。F1-ATP酶一般在線粒體膜上表達，偶爾在肝細胞和腫瘤細胞上也能表達，Vγ9Vδ 2γδT細胞能被異常表達在腫瘤細胞表面的Fl-ATP酶激活，在載脂蛋白A-1（apoA-1）的參與下還能強化此激活作用，其機制在于F1-ATP酶能夠與apoA-1形成復合物遞呈磷酸化抗原使其被Vγ9+Vδ2+TCR識別［18］。最近有研究表明，Vγ9Vδ2γδT細胞識別磷酸化抗原依賴于嗜乳脂蛋白3A1（BTN3A1，也稱為CD277），BTN3A1是B7超蛋白家族的成員，在Vγ 9+Vδ2+TCR識別磷酸化抗原中發揮著重要的作用，然而BTN3A1與磷酸化抗原之間相互作用的分子機制還需進一步研究［19］。內皮細胞蛋白C受體（EPCR）是近些年來新發現的γδTCR的配體，是C蛋白通路的重要組成部分，屬于MHCⅠ/CD1類蛋白分子，在缺氧和炎癥狀態下保護內皮屏障。EPCR僅在內皮細胞上表達，內皮細胞是CMV感染的主要靶點，在CMV感染的上皮細胞和上皮腫瘤細胞EPCR表達會上調，γδTCR與EPCR的相互作用使得γδT細胞能夠識別CMV感染的上皮細胞和上皮腫瘤細胞［20］。

γδT細胞除了通過γδTCR識別腫瘤抗原外，還可以通過自然殺傷細胞受體（NKR，如NKG2D、DNAM-1、NKp30、NKp44和NKp46等）識別表達在腫瘤細胞上的相應的配體識別腫瘤細胞［21］。NKR在NK細胞中能夠調節NK細胞的活化和功能，在γδT細胞中發揮著免疫監視的作用，能夠區分轉化的細胞以及感染的細胞。NKG2D是一種C型凝集素受體，其配體在大多正常組織上不表達而在腫瘤細胞上高表達，γδT細胞可以通過NKG2D識別其配體對腫瘤細胞行使其殺傷作用。目前在人類細胞中發現的NKG2D的配體包括MHCⅠ類分子相關蛋白（MICA/MICB）和6種ULBP結合蛋白（ULBP1-6）［22］。之前一直認為NCR是NK細胞特有的，然而近些年在活化的小腸上皮內淋巴細胞（intraepithelial lymphocytes，IELs）和固有樣淋巴細胞（innate lymphoid cells，ILCs）中均發現了NCR的表達［23］。盡管γδT細胞在正常情況下不表達NCR，但在TCR激動劑持續的刺激以及IL-15或IL-2的誘導下大部分γδT細胞能夠表達NCR，并且這一現象基本上只在Vδ1+γδT細胞上出現，Vδ2+γδT細胞尚未發現此現象［24］。Vδ1+γδT細 胞 誘 導 產 生 的NCR主 要 有NKp44、NKp30、NKp46，這些NCR+Vδ1+γδT細胞具有更強的對腫瘤細胞的靶向殺傷能力和分泌IFN-γ的能力［21，25］。基于這些研究，已經有人開發出了新型細胞產品NCR+Vδ1+γδT細胞用于腫瘤過繼免疫治療，并且能夠有效控制慢性淋巴細胞白血病的生長和擴散［26］。

2.2 γδT細胞抗腫瘤機制γδT細胞可以通過多種途徑發揮直接的抗腫瘤作用：如通過釋放穿孔素-顆粒酶裂解腫瘤細胞或Fas-FasL和TRAIL途徑誘導腫瘤細胞的凋亡，還可以通過ADCC途徑以及分泌細胞因子（如IFN-γ和TNF-α）殺傷腫瘤細胞［5］。

γδT細胞還可以通過影響B細胞、αβT細胞、樹突狀細胞（DC細胞）、NK細胞等其他免疫細胞的功能間接發揮抗腫瘤作用。有文獻指出當Vγ9Vδ2T細胞和IPP、IL-21在體外共孵育時，Vγ9Vδ2T細胞會顯示出濾泡輔助性T（Tfh）細胞的特點，提高B細胞分泌抗體的能力［27］。γδT細胞還可以作為αβT細胞的抗原遞呈細胞，參與αβT細胞的活化過程，使na?ve αβT細胞分化為效應T細胞，發揮抗腫瘤作用。當受到腫瘤抗原刺激時，γδT細胞會上調抗原遞呈分子HLA-DA、共刺激和黏附分子（CD80、CD86和CD40等）的表達，γδT細胞還會上調清道夫受體CD36的表達，參與腫瘤細胞碎片的清除，此時γδT細胞會發揮其抗原遞呈細胞的功能引起抗原特異性CD8+T細胞的應答［28］。γδT細胞還可以促進DC細胞的成熟，反過來，DC細胞也能誘導γδT細胞的活化和增殖。有研究表明DC細胞的成熟依賴于TNF-α和細胞之間的相互接觸，γδT細胞分泌的TNF-α、γδT細胞與DC細胞的相互接觸促進了DC細胞的成熟，這兩者的交互作用能夠加強γδT細胞對腫瘤細胞的識別和殺傷作用［29］。

3 γδT細胞促進腫瘤發展的機制

雖然γδT細胞能夠通過直接殺傷腫瘤細胞、分泌細胞因子（IFN-γ、TNF-α等）、促進DC細胞成熟等方式發揮抗腫瘤作用，但這一功能往往會被腫瘤微環境所抑制，腫瘤微環境甚至會促使γδT細胞轉變為促進腫瘤進展的亞群。

目前我們所知的γδT細胞的促腫瘤能力主要來源于其分泌的IL-17。IL-17是一種促炎因子，能夠促進慢性組織炎癥的發展進而促進腫瘤的進展。在多種惡性腫瘤（如胰腺癌、肝癌、非小細胞肺癌、乳腺癌等）中均發現IL-17水平升高與腫瘤的轉移和不良預后有關［30］。分泌IL-17的γδT（γδT17）細胞在健康個體中很少發現，但在一些疾病環境（如腦膜炎和癌癥）中則會發現γδT17細胞的聚積。有文獻證實，結直腸癌病人腫瘤部位上皮屏障的破壞會引起微生物產物和炎性樹突狀細胞的聚積，促使γδT細胞向γδT17細胞極化［31］。激活的炎癥樹突狀細胞會誘導γδT17細胞分泌IL-17、IL-8、TNF-α、粒細胞集落刺激因子等。IL-17進一步促進腫瘤部位血管增生、募集免疫抑制性MDSCs到腫瘤部位發揮促腫瘤作用［3，32］。肺是一種黏膜組織，定植著多共生菌，JIN等［33］發現當肺癌發生時肺部的總菌群載量增加但菌群多樣性減少，腫瘤部位菌群的失調刺激組織駐留的γδT細胞活化，使之分泌大量的IL-17和其他促炎介質，進而促進中性粒細胞浸潤和腫瘤細胞增殖，這進一步加劇炎癥和菌群失調，加速腫瘤進展的惡性循環。

有研究者證實γδT細胞在γδTCR單抗和TGF-β的刺激下會轉變為FOXP3+γδTreg細胞［34］。γδTreg細胞和傳統Treg細胞的功能類似，能夠分泌多種抑制性細胞因子，如IL-10和TGF-β，抑制αβT細胞對腫瘤的免疫應答。腫瘤微環境中存在著大量的免疫抑制分子，是否會影響γδT細胞對腫瘤的作用呢？研究發現，腫瘤浸潤的γδT細胞往往會發生表型或（和）功能的改變。在胰腺癌病人中發現γδT細胞廣泛分布于腫瘤間質中，而在正常胰腺中則無分布，并且腫瘤浸潤的γδT細胞具有獨特的表型，高表達趨化因子受體CCR2、CCR5和CCR6，提示腫瘤微環境中可能存在多種趨化因子趨化γδT細胞向腫瘤部位浸潤。胰腺癌微環境中的γδT細胞高表達FOXP3和程序性死亡受體-配體PD-L1，抑制αβT細胞的增殖和活化，使腫瘤部位的αβT處于免疫抑制或功能耗竭狀態［35］。

由此可見，腫瘤微環境能夠募集大量的γδT細胞向腫瘤部位浸潤，并改變它們的表型和功能，腫瘤浸潤的γδT細胞進而又能加劇炎癥、促進血管增生、招募MDSCs等抑制性細胞，進一步促進腫瘤的進展。因此，若能糾正腫瘤微環境，逆轉腫瘤浸潤的γδT細胞的負調作用，對于γδT細胞用于腫瘤免疫治療將有重要意義。

4 基于γδT細胞的腫瘤免疫治療

腫瘤免疫治療通過重新啟動或增強腫瘤病人的抗腫瘤免疫反應，恢復機體正常的抗腫瘤免疫反應，從而控制與清除腫瘤。目前基于αβT細胞的腫瘤免疫治療已經取得了一定進展，但治療的持久性和有效性還需進一步改進。這是由于αβT細胞的活化依賴于特定腫瘤相關抗原（TAA）、MHC分子以及共刺激信號。一旦TAA、MHC分子或共刺激信號丟失，αβT細胞對腫瘤的殺傷能力就會降低甚至導致αβT細胞的失能［36］。

由于γδT細胞自身識別腫瘤抗原無MHC限制性，且對腫瘤細胞具有較強的細胞毒作用，并且在體外、體內均能大量擴增，γδT細胞在腫瘤免疫治療中有巨大的應用前景。然而，由于γδT細胞自身對腫瘤的發展具有雙重作用，為了保證γδT細胞在腫瘤免疫治療中發揮積極的抗腫瘤作用而不是促腫瘤作用，往往不會直接使用未經處理的γδT細胞進行腫瘤免疫治療，而是使用經特異性擴增、具有特定亞型的γδT細胞進行治療，目前研究最多、最具應用前景的是Vγ9Vδ2γδT細胞和Vδ1γδT細胞。

Vγ9Vδ2γδT細胞主要存在于人外周血中，占外周血γδT細胞的50%～70%，能夠識別磷酸化抗原并被其活化。已經有研究證實將分選得到的γδT細胞在氨基二碳酸鹽類藥物（N-BPs類藥物，如唑來膦酸）和IL-2或的刺激下能夠激活Vγ9Vδ2γδT細胞并實現Vγ9Vδ2γδT細胞的特異性擴增。使用體外擴增的Vγ9Vδ2γδT細胞進行過繼轉輸治療時，往往也會伴隨使用唑來膦酸和IL-2以維持Vγ9Vδ2γδT細胞的活化狀態，并增加腫瘤細胞對Vγ9Vδ2γδT細胞的殺傷敏感性［37］。轉輸Vγ9Vδ2γδT用于腫瘤免疫治療已在多種晚期實體瘤的臨床試驗中初步顯示出較好的安全性與療效。ALNAGGAR等［38］發現將Vγ9Vδ2γδT細胞與唑來膦酸在體外培養擴增后過繼轉輸給Ⅳ期膽囊癌的病人給予治療，治療8個療程（前6個療程是每2周1個療程，后2個療程是每4周1個療程，每個療程治療3次，每次輸注4×108個Vγ9Vδ2γδT細胞）后發現腫瘤的體積減小，病人的生活質量提高，淋巴結明顯縮小，未見明顯的副作用。研究者還發現Vγ9Vδ2γδT細胞治療后功能性CD4+T細胞和CD8+T細胞比例有所升高，而耗竭的CD4+T細胞和CD8+T細胞的比例降低［38］。

Vδ1γδT細胞是一個近些年被廣泛關注的具有較強抗腫瘤活性的亞群，能夠被多種配體激活，如應激反應產生的自身抗原，CD1c/d遞呈的糖脂抗原以及多種潛在的未發現的配體［39］。Vδ1γδT細胞具有很強的抗腫瘤活性，與Vγ9Vδ2γδT細胞相比，Vδ 1γδT細胞的活化不依賴于N-BPs類藥物，并且能在體內長時間參與循環，有望維持長期的治療效果。雖然Vδ1γδT細胞的比例在外周血的比例不高，但目前人們已經開發出成熟的在體外擴增Vδ1γδT細胞的方法，將分選得到的γδT細胞在TCR激動劑和多種細胞因子（如IL-4、IL-21、IFN-γ和IL-1β）的刺激下3周內能夠將Vδ1γδT細胞擴增至1 000倍，并且能夠將初始比例小于0.5%的Vδ1γδT的比例提高至超過70%［26］。Vδ1γδT細胞對急性髓系白血病等多種淋巴系和髓系血液瘤具有較好的治療效果，過繼轉輸Vδ1γδT細胞治療能夠降低患者血液和靶器官中的腫瘤負荷，顯著延長患者的存活時間，且無明顯毒性［40］。

近些年，CAR-T細胞在治療急性白血病和非霍奇金淋巴瘤方面取得了極大的進展，被認為是最有前景的腫瘤治療方式之一。然而，CAR-T細胞免疫療法在臨床應用中還存在著細胞因子風暴、脫靶效應、對實體瘤效果不佳以及治療后復發率高等問題［41］。由于γδT細胞獨特的識別腫瘤的能力，人們開始思考CAR-γδT細胞是否能夠成為另一個有巨大潛力的用于腫瘤過繼細胞免疫治療的效應細胞［42］。DENIGER等［43］曾構建出靶向CD19的CARγδT細胞，發現CAR-γδT細胞在體內、體外對CD19+的腫瘤細胞的細胞毒性均有明顯的提高，說明CARγδT細胞有望用于治療腫瘤。GD2是一種神經節苷脂，廣泛表達于神經母細胞瘤細胞表面和其他幾種癌癥類型上，為了限制CAR-γδT細胞的毒副作用，FISHER等［44］將Vγ9Vδ2+T細胞進行結構改造設計了一個靶向GD2的CAR-γδT細胞。此設計中，CAR-γδT細胞的激活需要兩個相互獨立的信號，γδTCR識別腫瘤抗原為第一信號，抗GD2的單抗識別GD2并激活下游的共刺激信號域提供第二信號，在這兩個信號的同時參與下CAR-γδT細胞才能被活化發揮抗腫瘤作用。由于正常的細胞不會被Vγ 9Vδ2+T細胞殺傷所以經修飾的靶向GD2的CARγδT細胞不會對正常組織產生毒性。CAPSOMIDIS［45］也表明他們構建出的靶向GD2的CAR-γδT細胞能夠維持向腫瘤部位的遷移能力和對腫瘤細胞特異性的細胞毒性。靶向CD19的CAR-γδT細胞用于治療淋巴瘤和白血病的臨床研究也正在開展，CAR-γδT細胞有望在將來成為一種新型的腫瘤免疫治療方式。

5 總結與展望

γδT細胞對腫瘤的影響及其用于腫瘤免疫治療的巨大潛力逐漸引起了人們的關注。由于γδT細胞識別腫瘤抗原無MHC限制性，γδT細胞用于腫瘤免疫治療也許能夠避免因MHCⅠ類分子下調而導致的免疫逃逸，同時也能夠避免免疫排斥反應，尤其適用于同種異體的過繼轉輸策略，在未來有望制備出現成的同種異體的細胞治療產品［46］。然而，γδT細胞用于腫瘤免疫治療仍然存在一些問題，如治療的反應率低以及如何保證γδT細胞發揮抗腫瘤作用而不是促腫瘤作用。為了解決這些問題，將對腫瘤具有特異性殺傷作用的γδT細胞純化出來或制備工程化的γδT細胞（如CAR-γδT細胞）用于腫瘤免疫治療將會提高γδT細胞治療的反應率并具有更好的治療效果。腫瘤微環境對γδT細胞的功能影響較大，如何糾正腫瘤微環境，逆轉γδT細胞的促腫瘤作用也是在未來的研究中我們應該關注的問題。分泌IFN-γ和IL-17的γδT細胞亞群之間的平衡對于治療的效果有較大的影響，在未來的臨床試驗中應該關注這一點，研究發現IL-23和TGF-β對于分泌IL-17的細胞的分化是至關重要的，可考慮使用抗IL-23或TGF-β的單克隆抗體阻止γδT細胞向γδT17細胞分化［47］。另一個需要關注的重要因素是微生物菌群的影響，目前已經有文獻報道了腫瘤部位的共生菌群通過影響γδT細胞進而影響腫瘤的進展，可以考慮聯合抗生素治療清除不利的菌群［33］。在未來的研究中，仍需繼續探索如何提高γδT細胞治療的效果以及如何逆轉腫瘤微環境對γδT細胞的影響，若解決了這些問題，γδT細胞免疫治療有望成為一種有巨大應用前景的新型腫瘤免疫療法。