TLR4/NF-κB 參與動脈粥樣硬化發生發展機制的研究進展

李嘉慧王欣佩冷 靜

(1.廣西醫科大學基礎醫學院免疫學教研室,南寧 530021； 2.廣西中醫藥大學,廣西高發傳染病中西醫結合轉化醫學重點實驗室,南寧 530200； 3.中國醫學科學院醫學實驗動物研究所,北京協和醫學院比較醫學中心,北京 100021)

心血管疾病(cardiovascular diseases,CVD)是世界范圍內死亡的主要原因。 據世界衛生組織(world health organization, WHO)統計,每年約有1790 萬的人死于CVD,占全球死亡人數的31%,超過75%的CVD 發生在中低收入水平國家。 致CVD 的病因有多種,大多數CVD 的根本原因是動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)的發生[1]。

AS 的發病機制尚不清楚,然而某些因素能夠增加AS 的發病概率,包括遺傳、環境和個體習慣,如吸煙、肥胖、糖尿病、高血壓等等[2]。

血脂升高是AS 發展的核心,近年來,越來越多的研究發現,慢性炎癥在AS 發病機制中起著重要的作用[3-4]。 這種炎癥信號與天然免疫和適應性免疫均有聯系[5]。 固有免疫作為機體抵抗外來病原菌的第一道防線,近年來較多的研究其在AS 發病中的影響。 Toll 樣受體(Toll-like receptor, TLR),TLR4 作為TLR 家族中的一員,通過激活下游炎性因子的分泌參與AS 從內膜脂質積聚到斑塊破裂的各個階段,因而被認為是影響AS 發生發展的重要靶點之一。

1 TLR4 的概述

1.1 TLR4 分布及分子結構

TLR 是一種重要的模式識別受體,通過識別各種病原相關分子模式(pathogen-associated molecule pattern,PAMP)在天然免疫中發揮重要的作用[6]。TLR4 是第一個發現的受體,分布于B 細胞、單核/巨噬細胞、平滑肌細胞、樹突狀細胞等細胞表面,能夠識別廣泛的危險信號分子,包括微生物成分,如脂多糖(LPS)和經過內源性修飾的分子,如氧化低密度脂蛋白(oxLDL)[7]。

TLR4 是一型跨膜蛋白,由胞外域、胞漿區和跨膜區三部分組成。 胞外域由亮氨酸富集的重復序列組成,參與對PAMP 的識別,通過跨膜區將信號轉導入細胞內。 胞漿區因與IL-1R 家族成員的胞漿區高度同源,因此稱為Toll/IL-1 受體(Toll/IL-1 receptor, TIR)結構域,用于募集含有TIR 結構域的銜接蛋白,進行下游的信號轉導[8]。 Toll 樣受體識別PAMP 在固有免疫中發揮作用,激活樹突狀細胞表達共刺激分子,將主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex, MHC)二類分子攜帶的抗原表達于樹突狀細胞表面,T 細胞識別發揮適應性免疫應答,因此Toll 樣受體在固有免疫和適應性免疫應答中發揮橋梁作用[9-10]。

1.2 TLR4 的兩條信號傳導通路

TLR4 識別配體發生在細胞表面,受體內化進行信號的傳導。 TLR4 是唯一可以激活兩條信號通路的TLR 受體:MyD88 依賴型信號通路和MyD88 非依賴型信號通路[11]。 分別由MyD88 和TRIF 兩種銜接蛋白與受體結合激活下游信號,分別產生促炎細胞因子和干擾素,進而激活T、B 淋巴細胞介導的適應性免疫應答,進一步殺傷入侵的病原微生物[12]。

1.2.1 MyD88 依賴性信號通路

MyD88 依賴型信號通路是在質膜上介導除TLR3 以外所有TLR 的共同信號轉導通路[13]。 髓樣分化蛋白88 (myeloid differential proteiN-88,MyD88)是一種銜接蛋白,有兩個特殊的結構域N端和C 端。 C 端含有TLR 結構域,其作用是募集受體激活信號通路。 N 端又稱為死亡結構域,其與IL-1R 相關激酶4(IL-1R related kinases-4, IRAK-4)相互作用,IRAK-4 磷酸化IRAK-1,IRAK-1 進一步激活腫瘤壞死因子受體相關因子6(tumor necrosis factor-associated factor 6, TRAF6)[14]。 TRAF6 是一種E3 泛素連接酶,TRAF-6 與轉化生長因子β 活化激酶-1(TAK1)相互作用,TAK1 與TAK1 結合蛋白1 和2(TAB1 和TAB2)結合后。 活化的TAK1 進一步激活NF-κB 抑制蛋白激酶復合物(IKK α、β、ε)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK),進而激活NF-κB 和AP-1 蛋白,激活后的轉錄因子進入細胞核,產生各種細胞因子和趨化因子,如白介素-6(interleukiN-6, IL-6)、白介素-1β(interleukiN-1β, IL-1β)、腫 瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、單核細胞趨化蛋白- 1 (monocyte chemoattractant proteiN-1, MCP-1)等[15-17]。

1.2.2 MyD88 非依賴性信號通路

MyD88 非依賴性信號通路是內體發生的另一條信號轉導通路。 TLR4 通過銜接蛋白TRAM 與TRIF 結合后,激活TRIF,TRIF 與TRAF3、TRAF6 以及受體相互作用蛋白1 和3(RIP1、RIP3)結合后,TRAF3 和TRAF6 活化,分別行使不同的激活通路[18-19]:TRAF3 與IKKε 結合,活化干擾素調節因子3(interferon regulatory factor3, IRF3),一型干擾素(interferon, IFN)產生[20]；TRAF6 在RIP1 的作用下與TAK1 結合,激活NF-κB 和MAPK 誘導細胞因子的產生[12]。

2 TLR4/NF-κB 在動脈粥樣硬化發展中的作用

TLR4 作為天然免疫TLR 家族中一員,它的上調及其下游通路的激活在AS 的發生中有著一定的地位。 TLR4 在人和小鼠的AS 過程中均有過表達,主要在病變的巨噬細胞和內皮細胞內,參與AS 的各個階段[21]。 有研究發現,與C57BL/6 小鼠相比,C3H/HeJ 小鼠在高膽固醇和飲食中具有抗AS 的能力。 這是由于C3H/HeJ 小鼠在TLR4 細胞質區存在點突變,導致TLR4 無功能,因此TLR4 可能是小鼠體內發生AS 的一種重要因素[22]。 Michelsen等[23]人通過抑制TLR4 和MyD88 基因表達,顯著降低Apo-e-/-小鼠主動脈粥樣硬化病變面積、斑塊脂質含量、巨噬細胞浸潤、內皮細胞對白細胞的黏附及循環促炎細胞因子,如MCP-1、IL-12 等的循環水平。 Edfeldt 等[24]研究發現,TLR4 在人AS 的內皮細胞、動脈粥樣斑塊上表達高度上調,因此TLR4 在人AS 的形成過程中有著重要的作用。

2.1 TLR4 在脂肪條紋形成中的作用

AS 是由于脂肪、血栓等在血管內皮沉積的一種慢性血管疾病。 血管內皮具有抗炎、抗凝血的功能,在維持血管完整性方面有著重要的作用。 脂質代謝障礙是AS 的病變基礎,它觸發了由慢性炎癥介導的免疫反應,導致血管內皮功能異常[25]。

血脂中的低密度脂蛋白與內皮細胞相互作用是AS 發生的開始。 美國心臟協會將血脂中的LDL增加到1.81～4.89 mmol/L 定義為高脂血癥[26]。 由于血脂負荷,血脂中LDL 增加后,LDL 被攝入內膜修飾為ox-LDL。 oxLDL 可激活T 細胞,分泌細胞因子和黏附分子,使得單核細胞阻滯,與內皮細胞接觸后形成巨噬細胞[27]。 oxLDL 的激活可促進巨噬細胞表面的TLR4 表達上調,促炎巨噬細胞吞噬脂質形成泡沫細胞,泡沫細胞的積累形成了脂肪條紋,是AS 的第一個標志。 Howell 等[28]人對TLR4活性和TLR4 缺陷的C3H/HeN 小鼠巨噬細胞體外進行oxLDL 誘導后,TLR4 活性的小鼠巨噬細胞分化為泡沫細胞的比例出現上調,此外,研究者在給予oxLDL 誘導前,用TLR4 單克隆抗體預處理C3H/HeN 小鼠巨噬細胞,巨噬細胞向泡沫細胞分化的比例從29%降到13%,因此他們認為TLR4 是oxLDL誘導巨噬細胞向泡沫細胞分化所必須的。 然而oxLDL 激活巨噬細胞表面TLR4 和引發的炎癥反應的確切機制尚不清楚。 最新的一項研究表明髓樣分化蛋白- 2 (myeloid differentiation protein 2,MD2),巨噬細胞表面的一種受體,在oxLDL 激活TLR4 中發揮著重要的作用,oxLDL 可直接與MD2結合,誘導巨噬細胞MD2/TLR4 復合物的形成和TLR4/MyD88/NF-κB 促炎級聯而引起TLR4 激活觸發炎癥反應,并發現MD2 缺乏或抑制可以阻止AS的發生[29]。 因此MD2 的作用為oxLDL 誘導炎癥反應提供了機制基礎。

單核細胞衍生的巨噬細胞是脂質斑塊形成的主要細胞。 Xu 等[30]研究表明TLR4 在人類和小鼠富含脂質的AS 病變中優先在巨噬細胞表達。Stoletor 等[31]給予斑馬魚高膽固醇飲食誘導血管脂質積累形成中,研究發現巨噬細胞攝取LDL 需要TLR4 參與。 平滑肌細胞在AS 形成的每一個階段也起著重要的作用。 Kiyan 等[32]研究發現oxLDL 通過與TLR4 結合誘導平滑肌細胞(smooth muscle cell, SMC)釋放粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF)與粒-巨噬細胞集落刺激因子 ( granulocyte macrophage colony stimulating factor, GM-CSF),提示SMC 參與巨噬細胞的主動調節。 Aviram 等[33]研究發現SMC 通過攝取oxLDL,使其表面的TLR4 上調,激活下游NF-κB通路,并釋放IL-1β、TNF-α 等炎性細胞因子,促炎的SMC 轉化為泡沫細胞,加速脂肪條紋的形成。

2.2 TLR4 在動脈斑塊形成中的作用

隨著病變的發展,SMC 由靜息狀態遷移至內膜活化參與動脈斑塊的形成,血管內膜發生增厚,SMC是內膜增厚的主要類型細胞[34]。 有研究發現在AS脂質核心區SMC 的TLR4 表達上調,因此TLR4 在動脈粥樣斑塊形成中起著重要的作用[35]。

Michelsen 等[23]用Apo-E-/-小鼠模型研究表明,TLR4 及其MyD88 的缺失使得主動脈斑塊的面積顯著減小,降低了AS 的嚴重程度。 Bj?rkbacka 等[36]用MyD88 缺失小鼠證明,TLR4 缺乏與冠狀動脈斑塊組成的改變有關,這種改變降低了促炎因子和趨化因子的表達。

2.3 TLR4 在AS 病變后期的作用

在AS 的病變后期,炎性細胞分泌的蛋白酶降解彈性蛋白、纖維蛋白、基質蛋白,斑塊不穩定甚至發生破裂。 基質金屬蛋白酶 - 9 ( matrix metalloproteinase-9, MMP-9)在動脈粥樣斑塊不穩定和破裂過程中發揮重要的作用。 oxLDL 通過TLR4/NF-κB 依賴途徑促進巨噬細胞釋放IL-8、IL-1β、TNF-α,上調MMP-9,加速斑塊的破裂[3]。

臨床研究表明,急性心肌梗塞(acute myocardial infarction, AMI)患者的破裂和易損斑塊的巨噬細胞和淋巴細胞比穩定型心絞痛(stable angina pectoris,SA)患者的細胞高,提示免疫反應的激活與斑塊破裂和易損斑塊進展有關。 組織學研究表明TLR4 在尸檢獲得的巨噬細胞浸潤的冠狀動脈斑塊中高表達,表明TLR4 參與動脈斑塊的破裂過程[37]。 Yu等[38]通過抽取AMI 患者破裂斑塊局部標本,分離單核細胞,患者斑塊周圍浸潤單核細胞的TLR4 高于全身水平。 說明TLR4 在冠狀動脈浸潤性巨噬細胞中的表達可能是冠狀動脈斑塊失穩和破裂的重要因素。 Montecucco 等[39]給予ApoE-/-小鼠抗-apoA-1 抗體,研究發現該抗體通過TLR4 途徑導致中性粒細胞和MMP-9 含量增加,膠原含量降低,進而增加動脈斑塊的易損性,致小鼠的死亡率增加23%。 纖維連接蛋白含有的額外結構域A(FNEDA)作為TLR4 的內源性配體,可激活TLR4 通路。Doddapattar 等[40]對Apo-/-小鼠的研究結果表明,FN-EDA 富集的微環境是通過TLR4 途徑誘導的動脈粥樣斑塊的不穩定。

2.4 NF-κB 在AS 發病過程中的作用

炎癥最重要的調節因子之一是轉錄因子NFκB。 NF-κB 被認為是一種促AS 的因子,它參與了AS 形成過程中的多個病理過程[41]。

人和動物模型的研究均表明了NF-κB 參與了AS 的病變過程。 Methe 等[42]發現急性冠脈綜合征和不穩定型心絞痛患者的外周血單核細胞和巨噬細胞的NF-κB 被激活,提示NF-κB 的激活是免疫介導的AS 進展的一種信號機制。 Tang 等[43]用siRNA敲低Apo-E KO 小鼠的TLR4 后,NF-κB 表達隨之被抑制,同時血漿中IL-1β、TNF-α 和MCP-1 水平也顯著降低。 Wolfrum 等[44]用NF-κB 抑制劑后,降低了Apo-E-/-小鼠主動脈根部動脈粥樣硬化病變面積。

在AS 病變的初期,oxLDL 激活內皮細胞發生炎癥反應,NF-κB 參與激活內皮細胞粘附分子如e-選擇素、血管細胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecules-1, VCAM - 1)、 細 胞 間 粘 附 分 子-1(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1),內皮細胞粘附分子通過與單核細胞的粘附作用,促進了AS 的發生[45]。 Plotkin 等[46]人給Apo-E-/-小鼠應用NF-κB 抑制劑后,減少了泡沫細胞的形成。

炎癥介導的VSMC 功能障礙導致動脈內膜增生是AS 發生的關鍵一步。 血管內皮損傷后,VSMC 由靜息狀態變為活化的過程中,NF-κB 家族成員p50、p65、p52、c-rel 和RelB 出現上調,抑制蛋白發生下調。 并且在VSMC 激活后,巨噬細胞浸潤與VCAM-1、MCP-1 表達平行,血管經過長時間的受損,腔面SMC 繼續高表達VCAM-1 和MCP-1,巨噬細胞持續增多,逐漸形成動脈斑塊[47]。 在對頸動脈狹窄患者的動脈粥樣斑塊研究中,NF-κB 過度激活,FasL 表達,NF-κB 參與促凋亡蛋白Fas 配體(Fas ligand,FasL)的轉錄調控,因此NF-κB/FasL 參與斑塊不穩定的機制[48]。

3 TLR4 作為靶點治療AS

AS 是作為一種其他心血管疾病的主要誘因,預防和治療AS 成為我們重點關注的問題。 TLR4 因在AS 的發生過程中有重要的作用,因此TLR4 及其下游通路可作為潛在的治療靶點。 Shen 等[49]研究發現,給予高脂飲食誘導的AS 模型兔子相比于阿托伐他汀治療組的TLR4/NF-κB 表達明顯升高,因此阿托伐他汀可能是通過抑制TLR4/NF-κB 途徑治療AS。 Boekholdt 等[50]對有冠狀動脈粥樣硬化的病人研究發現TLR4Asp299Gly 多態性與疾病的發生有關。 在使用普伐他汀治療后,病人動脈內膜中膜厚度變薄, 斑塊減??； 并且研究發現攜帶TLR4Asp299Gly 基因的心血管事件風險低于非攜帶者,使攜帶該變異等位基因從普伐他汀的獲益更多。 有研究表明,聯合使用阿托伐他汀和普羅布考對高脂飲食喂養的Apo-E-/-缺乏的小鼠AS 作用比單獨使用阿托伐他汀對AS 的作用強,通過增加抑制NF-κB 調節的TLR4,對AS 的恢復具有一定的意義[51]。

4 討論

TLR4/NF-κB 是固有免疫的一條重要通路,其介導的炎癥反應在AS 的形成、發展等各個階段發揮重要的作用。 近年來,越來越多的研究通過基因誘導、敲除等方法,證實了TLR4 及其下游信號通路與AS 發病的相關性,并且作為治療AS 的一個重要靶點。 但目前還存在一些問題需要更深入研究:oxLDL/TLR4 通過上調巨噬細胞表面的CD36 引起巨噬細胞的泡沫化,進而引起細胞因子的釋放誘導炎癥反應,但是并未有研究證實TLR4 與細胞因子釋放的直接作用機制,也未有研究表明TLR4 在巨噬細胞脂質代謝中膽固醇蓄積中的作用；其次TLR4基因多態性與AS 等心血管事件風險的發生關系存在著爭議。 有研究表明攜帶TLR4Asp299Gly 患者給予他汀類藥物治療獲益更多, 因此TLR4Asp299Gly 基因多態性對AS 的發生有保護作用,而也有研究發現Asp299Gly 攜帶者男性患者心肌梗死風險是增加的,而女性無關聯。 因此需要更多的臨床樣本進一步闡明TLR4 基因多態性與AS發生的關系。 因此我們期望在今后的研究中,通過新發現為防治AS 及AS 的發生機制提供新見解。